1. РНХ уусмалын шингээлтийг илрүүлэх
280, 320, 230, 260 нм-ийн шингээлт нь нуклейн хүчил, дэвсгэр (уусмалын булингар), давсны концентраци, уураг зэрэг органик бодисын утгыг тус тус илэрхийлнэ.Ерөнхийдөө зөвхөн OD260/OD280 (Харьцаа, R)-ийг харна уу.1.8~2.0 үед РНХ-ийн уураг болон бусад органик бодисын бохирдлыг тэсвэрлэх боломжтой гэж бодож байгаа ч Tris-ийг шингээлтийг илрүүлэх буфер болгон ашиглах үед R утга 2-оос их байж болно (ерөнхийдөө <2.2 байх ёстой).R<1.8 үед уусмал дахь уураг болон бусад органик бодисын бохирдол илүү тодорхой болж, хэрэгцээ шаардлагад нийцүүлэн РНХ-ийн хувь заяаг тодорхойлж болно.R>2.2 бол РНХ нь нэг нуклейн хүчил болж гидролиз болсон гэсэн үг.
2.РНХ-ийн электрофоретик загвар
Ерөнхийдөө денатуржуулагч гель нь РНХ-ийн электрофорезид ашиглагддаг боловч хэрэв энэ нь зөвхөн РНХ-ийн чанарыг илрүүлэхэд зориулагдсан бол денатуржуулагч гель шаардлагагүй бөгөөд энгийн агароз гель хэрэглэж болно.Электрофорезын зорилго нь 28S ба 18S зурвасын бүрэн бүтэн байдал ба тэдгээрийн харьцаа буюу мРНХ-ийн т рхэцийн нэгдмэл байдлыг илрүүлэх явдал юм.Ерөнхийдөө, хэрэв 28S ба 18S зурвасууд нь тод, тод, хурц (зургийн ирмэгийг хэлж байгаа нь тодорхой), 28S-ийн тод байдал нь 18S зурвасаас хоёр дахин их байвал бид РНХ-ийн чанарыг сайн гэж үздэг.
Дээрх нь бидний түгээмэл ашигладаг хоёр арга боловч эдгээр хоёр аргын аль нь ч РНХ-ийн уусмалд РНазын үлдэгдэл байгаа эсэхийг тодорхой хэлж чадахгүй.Хэрэв уусмалд маш бага хэмжээний RNase байгаа бол бид үүнийг дээрх аргаар илрүүлэхэд хэцүү байдаг ч дараагийн ферментийн урвалын ихэнх нь 37 хэмээс дээш температурт удаан хугацаанд явагддаг.Энэ мэтчилэн РНХ-ийн уусмалд маш бага хэмжээний RNase байгаа бол дараагийн туршилтуудад тэдний үүрэг гүйцэтгэхэд маш тохиромжтой орчин, цаг хугацаа бий болох бөгөөд мэдээж энэ үед туршилт хүйтэн байх болно.Доор бид РНХ-ийн уусмалд RNase үлдэгдэл байгаа эсэхийг баталгаажуулах аргыг танилцуулж байна.
3. Дулаан хадгалах туршилт
Дээжийн концентрацийн дагуу РНХ-ийн уусмалаас хоёр 1000 нг РНХ гаргаж аваад 0.5 мл центрифугийн хоолойд нэмж, рН 7.0 Tris буферээр нийт 10 ul эзэлхүүнтэй болгож, дараа нь хоолойны тагийг битүүмжилнэ.Тэдгээрийн аль нэгийг нь 70 градусын тогтмол температуртай усан ваннд хийж, 1 цагийн турш халаана.Нөгөө хэсгийг нь -20°С-т хөргөгчинд 1 цаг хадгална.Хугацаа дуусахад электрофорез хийх хоёр дээжийг авна.Электрофорез дууссаны дараа хоёрын электрофорезийн туузыг харьцуулна.Хэрэв энэ хоёрын туузууд хоорондоо уялдаатай эсвэл мэдэгдэхүйц ялгаагүй бол (мэдээжийн хэрэг, тэдгээрийн туузууд нь 2-р аргын нөхцөлийг хангаж байгаа) энэ нь РНХ-ийн уусмалд RNase-ийн үлдэгдэл бохирдол байхгүй, РНХ-ийн чанар маш сайн гэсэн үг юм.Эсрэгээр, хэрэв 70 ° C-д өсгөвөрлөсөн дээж нь илт задралыг харуулсан бол энэ нь РНХ-ийн уусмалд RNase-ийн бохирдол байгааг илтгэнэ.
2 РНХ гаргаж авах туршилтын арга, техник
РНХ-г гаргаж авахад бидний байнга тулгардаг асуудлууд нь: (1) РНХ-ийн гарц бага;(2) РНХ давсны ноцтой бохирдолтой;(3) РНХ нь органик уусгагчийн ноцтой бохирдолтой;(4) дээжийн доройтол болон бусад асуудлууд
1. Түгээмэл хэрэглэгддэг нийт РНХ ялгах урвалжууд
Гуанидин изотиоцианатын арга ба Тризол арга нь амьтны эд, амьтны эсээс нийт РНХ-ийг гаргаж авахад хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг арга юм.Энэ нь ялангуяа туулайн арьс, амьтны холбогч эдээс нийт РНХ-ийг гаргаж авах гэх мэт жижиг сорьц, эд эсийг ялгахад тохиромжтой;Нэмж дурдахад Тризолыг ерөнхий зориулалтын задралын урвалж болгон ургамлын эд, бактери, мөөгөнцөр болон бусад эд эсийг олборлоход ашиглаж болно.Камелия, цайны навч, рапс гэх мэт полисахарид ба полифенол агуулсан ургамлын эдэд CTAB аргыг мөн нийт РНХ-г гаргаж авах боломжтой.
Уламжлалт аргын хувьд давхар баганын арга нь хэвийн температурын ажиллагаатай, RNase нэмэх шаардлагагүй, аюулгүй байдал - хлороформ, фенол болон бусад органик урвалжуудыг олборлодог тул маш их алдартай байдаг.(санал болгож буй бүтээгдэхүүн )
2. Амьтны эд эсээс нийт РНХ гаргаж авах
(1) Хэрэв шинэхэн биш бол шинэхэн эдийг сонгохыг хичээ (гурван сарын дотор - 80 ℃ хөргөгчинд эсвэл шингэн азотоор хөлдөөсөн байвал зохимжтой. Эд эсийг огтлохдоо тасалгааны температурт шууд огтолж болохгүй, мөсөн хайрцагт хийж, дахин хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх хэрэгтэй.
(2) Цэвэр хайч, хясаа ашиглан жижиг салфетка хайчлах, дээжийг огтолж авахдаа эд эсийн төв хэсгийг таслахыг оролдох, эсвэл эхлээд дундаас нь том эдийг огтолж, дараа нь дээжийг шинэ зүсэлт хийх байрлалд зүснэ.Авсан эдийг бүрэн хэрчиж, жижиглэсэн эдийг RNase-гүй EP хоолойд хийж, лизатыг нэмж, хэрчиж авсан эдийг лизатад бүрэн ил гаргаж, нэгэн төрлийн болгоход бэлтгэнэ.
(3) Хэвийн эдүүдийн хувьд нэгэн төрлийн болгохын тулд ногоон буурцагны хэмжээтэй (30-60 мг) эдийг сонгоно.Хэрэв эд эсэд их хэмжээний уураг, өөх тос эсвэл элэг зэрэг өтгөн ширхэгт эд агуулагддаг бол зүссэн эдүүдийн хэмжээг зохих ёсоор нэмэгдүүлэх буюу багасгах (заавал биш) 10~20 мг-ыг сонгоно).
(4) Хэрэв загасны булчин, сам хорхойн мах, медуз болон усны агууламж өндөртэй бусад эд эсийг гаргаж авбал дээжийн хэмжээг зохих ёсоор нэмэгдүүлэх шаардлагатай (зөвлөдөг 100-200 мг).
(5) Нөхцөл байдал зөвшөөрвөл амьтны эдийг, хэрэв тийм төхөөрөмж байхгүй бол өндөр дамжуулалттай эдийг нэгэн төрлийн нэгэн төрлийн болгосны дараа шууд гаргаж авч болно.
(6) Эцсийн олборлолтын дараа олж авсан РНХ-ийг РНХ-ийн задралыг багасгахын тулд нэн даруй мөсөн хайрцагт хийнэ.
3. Амьтны эсийн РНХ олборлолт
(1) Түдгэлзүүлэх эсүүд: шууд центрифуг хийж, орчинг хаяж, ариутгасан PBS-ээр 1-2 удаа угааж, дараа нь зохих хэмжээний PBS-ээр түдгэлзүүлж, дараа нь задралд зориулж лизат нэмнэ.Шингэнийг бүрэн хаясны дараа тунадасны эсүүдэд лизатыг шууд нэмж болохгүй.Энэ нь гаднах давхаргад задарсан эсүүдийн дараа ялгарсан гистоны багцыг тунадасжсан эсийн гадна талд наалдуулах бөгөөд ингэснээр үрлэн доторх эсийн лизаттай холбоо тогтоохыг хязгаарлана., үүний үр дүнд эсийн бүрэн задралгүй, РНХ-ийн гарц буурдаг.
(2) Хагас наалдсан эсвэл нягт наалдаагүй эсүүд: Орчуулагчийг хаясны дараа PBS-ээр 1-2 удаа угааж, дараа нь зохих хэмжээний PBS-ийг шууд шингээж, өсгөвөрлөх савыг пипетк эсвэл буугаар үлээж эсийг үлээж, РНХгүй эсүүдэд шилжүүлнэ.Лизатыг задлахын тулд ферментийн EP хоолойд нэмнэ.
(3) Наалдсан эсүүд: эхлээд трипсинээр шингээж, дараа нь RNase агуулаагүй EP хоолойд цуглуулж, дээд давхаргыг зайлуулахын тулд центрифуг хийж, илүүдэл трипсинийг арилгахын тулд PBS-ээр 1-2 удаа угааж, зохих хэмжээний PBS-ээр дахин түдгэлзүүлж, дараа нь олборлох алхам руу шилжинэ.
4. Ургамлын РНХ олборлолт
Ургамлын эдүүд нь фенолын нэгдлээр баялаг, эсвэл полисахаридаар баялаг, эсвэл тодорхойгүй зарим хоёрдогч метаболит агуулсан, эсвэл RNase-ийн өндөр идэвхжилтэй байдаг.Эдгээр бодисууд нь эсийн задралын дараа РНХ-тэй нягт нийлж уусдаггүй цогцолбор буюу коллоид тунадас үүсгэдэг бөгөөд тэдгээрийг арилгахад хэцүү байдаг.Тиймээс бид ургамлын эдийг гаргаж авахдаа ургамлын иж бүрдлийг сонгох хэрэгтэй.Иж бүрдэл дэх лизат нь полифенолыг хялбар исэлдүүлэх, полисахаридын нэгдлүүд болон нуклейн хүчлүүдийг салгах асуудлыг үр дүнтэй шийдэж чадна.
(Полисахарид полифенолын ургамлын РНХ-ийн хандыг авахын тулд санал болгож буй бүтээгдэхүүнүүд:
(1) Ургамлын хальс, нухаш, үр, навч зэргийг зуурмагт бүрэн нунтагласан байх ёстой.Нунтаглах явцад дээжийг хайлуулахгүйн тулд шингэн азотыг цаг тухайд нь нөхөх шаардлагатай.РНХ-ийн задралаас зайлсхийхийн тулд нунтагласан дээжийг лизат руу хурдан нэмж, сэгсэрнэ.
(2) Цагаан будаа, улаан буудайн навч зэрэг эслэгээр баялаг дээжийн хувьд олборлолтын хэмжээг зохих ёсоор багасгах хэрэгтэй, эс тэгвээс эдийг нунтаглах, задлах үйл явц дуусаагүй тул олборлосон РНХ-ийн гарц бага байх болно.
(3) Анар жимс, тарвас жимс, тоорын жимс гэх мэт усны өндөр агууламжтай ургамлын эдэд дээжийн хэмжээг зохих ёсоор нэмэгдүүлэх шаардлагатай (100-200 мг нэмэлт).
(4) Ургамлын навч, үндэслэг иш, хатуу жимс болон бусад материал зэрэг ургамлын эдийг зуурмаг дахь найрлагыг сайтар нунтаглахын тулд шингэн азотыг ашиглахыг зөвлөдөг бөгөөд дараа нь олборлох үе шатыг үргэлжлүүлнэ.Уламжлалт эдийг нэгэн төрлийн болгох бодис нь ургамлын эдийг нэгэн төрлийн болгоход үр дүнгүй байж болох тул ерөнхийдөө хэрэглэхийг зөвлөдөггүй.
5. РНХ-г задлахаас сэргийлэх арга хэмжээ
(1) Давтан хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийхийн тулд эд эсийн дээжийг аль болох шинэхэн байх ёстой.
(2) Олборлох явцад эдийг бүрэн нунтагласан байх ёстой бөгөөд эд эсийн хэмжээ хэт их битгий хэл хэтэрхий бага байж болохгүй.
(3) Дээжийг бүрэн задлахын тулд лизат нэмсний дараа хангалттай инкубацийн хугацаа өгөх ёстой.
(4) Тризолын аргыг гаргаж авахдаа давхраажилтын дараа дээд давхаргыг шингээх зарчим нь "илүү амьсгалахаас бага амьсгалахыг илүүд үздэг" бөгөөд дунд давхарга руу хандлах ёсгүй, эс тэгвээс энэ нь геномын ДНХ-ийн ноцтой бохирдол үүсгэдэг.
(5) Угаах үед угаах шингэн нь хоолойн хананд бүрэн нэвчиж, сайтар угааж байх ёстой.
(6) Багана олборлох аргын хувьд угаасны дараа баганыг салгахаас гадна шингээх баганыг мөн хэт цэвэрхэн вандан сандал дээр байрлуулж, органик уусгагчийг бүрэн ууршуулж, хуурай болтол нь 5-10 минутын турш үлээлгэнэ.
(7) Баганын аргын сүүлчийн шүүрэлтийн үед DEPC ус нэмсний дараа 3-5 минутын турш өсгөвөрлөх буюу DEPC-ийн усыг урьдчилан 60°С хүртэл халааж шүүрлийн гарцыг нэмэгдүүлнэ.Уламжлалт Тризолыг задлах ба изопропанол тунадасжуулах аргад эцсийн РНХ нь DEPC усанд уусдаг тул уусгахад тохиромжтой хугацаа өгч, центрифугийн хоолойн ёроолыг пипеткийн үзүүрээр тасралтгүй үлээж байх ёстой.
3 ТРНХ бага концентраци/чанар муутай байх шалтгаан ба шийдэл
1. Ургац хэт бага байна
Олж авсан дээж хэт бага, нийт хэмжээ нь хангалтгүй, эсхүл гаргаж авсан дээж хэт их, задрал нь дуусаагүй;зохих чанарын эд эс буюу эсийг олборлоход ашиглах, дээжийн урьдчилсан боловсруулалтыг сайтар хийж, задрал нь хангалттай байх ёстой.
2. Геномын үлдэгдэл
Тризолын аргаар олборлох үед дээд давхаргыг давхарласаны дараа дунд давхарга руу сорох үед геномын ноцтой бохирдол үүсэх болно;Дунд давхарга руу сорохоос зайлсхийхийн тулд давхарга тавихдаа онцгой анхаарал тавих хэрэгтэй.Хэрэв баганын аргыг олборлоход ашиглаж байгаа бол DNase I агуулсан иж бүрдлийг гаргаж авахдаа сонгож болно.Мембран дээр шингэсэн нуклейн хүчил нь DNase I-д шууд шингэдэг бөгөөд энэ нь ДНХ-ийн үлдэгдлийг ихээхэн хэмжээгээр бууруулдаг.
3. РНХ-ийн задрал
Энэ нь олборлосон дээжийн өөрөө доройтол, эсвэл олборлох явцад үүссэн доройтол байж болно;аль болох шинэхэн дээжийг РНХ-г гаргаж авах, цуглуулсан дээжийг шингэн азот буюу -80°C хөргөгчинд цаг тухайд нь хадгалах ба дахин хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх хэрэгтэй.RNase/DNase-гүй зөвлөмжүүд, центрифугийн хоолой болон бусад материалыг РНХ олборлох процесст ашиглах ёстой.Олборлох үйл явц аль болох хурдан явагдах ёстой.Олж авсан РНХ-г мөсөн хайрцагт хийж, -80 хэмд хадгална.Хэрэв гаргаж авсан РНХ-ийг гель электрофорезоор илрүүлэх шаардлагатай бол олборлосны дараа шууд электрофорез хийж, электрофорезын буферийг шинээр бэлтгэсэн бодисоор солино.
4. Давс ба органик уусгагчийн үлдэгдэл
Экстракцийн урвалжууд нь фенол, гуанидины давс, угаах уусмал нь этанол агуулдаг.Экстракцийн явцад лизатыг бүрэн шингээж, устгаж, угаах уусмалыг бүрэн хатаагаагүй.Үлдэгдэл давс, органик уусгагч нь дараагийн урвуу транскрипц болон ПГУ-д хортой.Дарангуйллын янз бүрийн зэрэгтэй тул олборлох явцад эд эсийн лизатыг бүрэн зайлуулж, угаах нь хангалттай байх ёстой бөгөөд ингэснээр хоолойны эргэн тойрон дахь ханыг угааж болно.Үүнээс гадна хоолойг хоослох, үлээлгэх нь зайлшгүй шаардлагатай алхам бөгөөд энэ нь органик бодисын үлдэгдлийг цаашид багасгах болно.
РНХ олборлолтын талаарх дэлгэрэнгүй мэдээллийг манай вэбсайтаас авна уу.
Дэлгэрэнгүй мэдээллийг www.foreivd.com.
Шуудангийн цаг: 2022 оны 12-р сарын 01
