Эхлэх материал: РНХ
Тоон урвуу транскрипцийн ПГУ (RT-qPCR) нь РНХ-ийг эхлэл материал болгон ашиглах ПГУ-ын туршилтанд ашигладаг туршилтын арга юм.Энэ аргын хувьд нийт РНХ буюу мессенжер РНХ (мРНХ) нь урвуу транскриптазаар эхлээд нэмэлт ДНХ (cDNA) болгон хувиргадаг.Дараа нь cDNA-г загвар болгон ашиглан qPCR урвалыг хийсэн.RT-qPCR нь генийн экспрессийн шинжилгээ, РНХ хөндлөнгийн баталгаажуулалт, бичил массивын баталгаажуулалт, эмгэг төрөгч илрүүлэх, генетикийн шинжилгээ, өвчний судалгаа зэрэг молекул биологийн төрөл бүрийн хэрэглээнд ашиглагдаж ирсэн.
RT-qPCR-ийн нэг ба хоёр шаттай аргууд
RT-qPCR-ийг нэг шаттай эсвэл хоёр шаттай аргаар хийж болно.Нэг үе шаттай RT-qPCR нь урвуу транскрипт ба ПГУ-ын олшруулалтыг хослуулсан бөгөөд урвуу транскриптаза ба ДНХ полимераза нь ижил буферийн нөхцөлд нэг хоолойд урвалыг дуусгах боломжийг олгодог.Нэг үе шаттай RT-qPCR нь зөвхөн дарааллын тусгай праймерыг ашиглахыг шаарддаг.Хоёр үе шаттай RT-qPCR-д урвуу транскрипц болон ПГУ-ын олшруулалтыг өөр өөр оновчтой буфер, урвалын нөхцөл, праймер дизайны стратеги ашиглан хоёр хуруу шилэнд хийнэ.
| Давуу тал | Сул тал | |
| Нэг алхам | Хоёр урвал нэг хоолойд явагддаг тул энэ арга нь туршилтын алдаа багатай байдаг
Цөөн пиптинг хийх нь бохирдох эрсдэлийг бууруулдаг
Өндөр хүчин чадалтай олшруулалт/скрининг хийхэд тохиромжтой, хурдан бөгөөд дахин давтагдах боломжтой | Хоёр үе шаттай урвалыг тусад нь оновчтой болгох боломжгүй
Хоёр үе шаттай урвалыг хослуулснаар урвалын нөхцөл эвдэрсэн тул мэдрэмж нь хоёр үе шаттай аргынхтай адил сайн биш юм.
Нэг дээжээр илрүүлсэн байны тоо бага байна |
| Хоёр алхам | Урт хугацаанд хадгалах, олон урвалд ашиглах боломжтой тогтвортой cDNA санг үүсгэх чадвар
Зорилтот генүүд болон лавлагаа генүүдийг нэг cDNA сангаас олон cDNA санг ашиглахгүйгээр олшруулж болно.
Урвалын буфер ба урвалын нөхцөл нь нэг урвалын ажиллагааг оновчтой болгох боломжийг олгодог
Өдөөгч нөхцлийн уян хатан сонголт | Олон гуурс ашиглах, соруураар илүү олон алхам хийх нь ДНХ-ийн бохирдлын эрсдлийг нэмэгдүүлдэг. мөн цаг хугацаа их шаарддаг.
Нэг алхамтай аргаас илүү оновчтой болгох шаардлагатай |
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Нэг алхам)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Нэг алхам)-Такман
RT Easyᵀᴹ I анхны хэлхээний CDNA синтезийн мастер премикс
Бодит цагийн PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Бодит цагийн ПГУ-ын Easyᵀᴹ-Takman
Нийт РНХ ба мРНХ-ийн сонголт
RT-qPCR туршилтыг зохион бүтээхдээ нийт РНХ эсвэл цэвэршүүлсэн мРНХ-ийг урвуу транскрипцийн загвар болгон ашиглах эсэхээ шийдэх нь чухал юм.Хэдийгээр мРНХ нь бага зэрэг өндөр мэдрэмжийг өгөх боломжтой боловч нийт РНХ байнга ашиглагддаг.Үүний шалтгаан нь нийт РНХ нь мРНХ-ээс илүү чухал давуу талтай байдаг.Нэгдүгээрт, процесс нь цөөн тооны цэвэршүүлэх алхмуудыг шаарддаг бөгөөд энэ нь загварыг тоон хэмжээгээр илүү сайн сэргээж, үр дүнг эхлэлийн эсийн дугаар хүртэл хэвийн болгох боломжийг олгодог.Хоёрдугаарт, энэ нь мРНХ-ийг баяжуулах алхамаас зайлсхийдэг бөгөөд энэ нь өөр өөр мРНХ-ийн нөхөн сэргэлтээс болж гажуудал гарахаас зайлсхийх боломжтой.Ерөнхийдөө ихэнх хэрэглээнд зорилтот генийн харьцангуй хэмжигдэхүүн нь илрүүлэх үнэмлэхүй мэдрэмжээс илүү чухал байдаг тул нийт РНХ ихэнх тохиолдолд илүү тохиромжтой байдаг.
Урвуу транскрипцийн праймер
Хоёр үе шаттай аргын хувьд cDNA урвалыг боловсруулахад гурван өөр аргыг ашиглаж болно: олиго(dT) праймер, санамсаргүй праймер эсвэл дарааллын тусгай праймер.Ихэвчлэн олиго(dT) праймер болон санамсаргүй праймерыг хослуулан хэрэглэдэг.Эдгээр праймерууд нь загварын мРНХ хэлхээнд холбогдож, синтезийн эхлэлийн цэг бүхий урвуу транскриптаза үүсгэдэг.
| Праймерын сонголт | Бүтэц ба функц | Давуу тал | Сул тал |
| Oligo(dT) праймер (эсвэл зангуу олиго(dT) праймер) | мРНХ-ийн поли(А) сүүл дэх тимины үлдэгдэлд уртассан задрал;anchor oligo(dT) праймер нь 3′ төгсгөлд G, C, эсвэл A агуулсан (зангууны талбай) | Поли(А) сүүлт мРНХ-ээс бүрэн хэмжээний cDNA-ийн нийлэгжилт
Эхлэх материал бага байгаа тохиолдолд хэрэглэнэ
Зангуу нь олиго(dT) праймер нь мРНХ-ийн 5′ поли(А) сүүлтэй холбогддог. | Зөвхөн поли(A) сүүлтэй генийг өсгөхөд тохиромжтой
Поли(А) дахь бэлтгэлийн талбайн*2-аас таслагдсан cDNA-г авна.
3′-ийн төгсгөлд холбох зориулалттай*
*Хэрэв зангуутай олиго(dT) праймерыг ашиглавал энэ боломж багасна |
| санамсаргүй праймер
| 6-аас 9 баазын урттай, РНХ-ийн транскрипцийн үед олон сайт руу залгаж болно | Бүх РНХ (тРНХ, рРНХ, мРНХ)
Чухал ач холбогдол бүхий хоёрдогч бүтэцтэй, эсвэл эхлэлийн материал бага байгаа тохиолдолд хуулбарлахад тохиромжтой
cDNA-ийн өндөр гарц | cDNA нь бүх РНХ-ээс урвуу хуулбарлагдсан байдаг бөгөөд энэ нь ихэвчлэн хүсээгүй бөгөөд зорилтот мРНХ-ийн дохиог шингэлж болно.
тайрсан cDNA авах |
| дарааллын тусгай праймерууд | Тодорхой мРНХ-ийн дараалалд чиглэсэн захиалгат праймерууд | тусгай cDNA номын сан
Мэдрэмжийг сайжруулах
Урвуу qPCR праймерыг ашиглах | Зөвхөн нэг зорилтот генийн синтезээр хязгаарлагддаг |
Урвуу транскриптаза
Урвуу транскриптаза нь ДНХ-ийг нэгтгэхэд РНХ ашигладаг фермент юм.Зарим урвуу транскриптазууд нь RNase идэвхжилтэй бөгөөд транскрипц хийсний дараа РНХ-ДНХ-ийн эрлийз хэлхээн дэх РНХ-ийн хэлхээг доройтуулж чаддаг.Хэрэв энэ нь RNase ферментийн идэвхжилгүй бол qPCR үр ашгийг нэмэгдүүлэхийн тулд RNaseH нэмж болно.Түгээмэл хэрэглэгддэг ферментүүд нь Moloney хулганы лейкемийн вирусын урвуу транскриптаз ба шувууны миелобластомын вирусын урвуу транскриптаза юм.RT-qPCR-ийн хувьд илүү өндөр термостаттай урвуу транскриптазыг сонгох нь хамгийн тохиромжтой бөгөөд ингэснээр cDNA-ийн нийлэгжилтийг өндөр температурт гүйцэтгэж, өндөр хоёрдогч бүтэцтэй РНХ-ийн амжилттай транскрипцийг баталгаажуулж, урвалын туршид бүрэн идэвхийг нь хадгалж, улмаар cDNA-ийн гарц өндөр болно.
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
Урьдчилан таамагласан M-MLV урвуу транскриптаза
Урвуу транскриптазын RNase H идэвхжил
RNaseH нь РНХ-ДНХ-ийн дуплексээс РНХ-ийн хэлхээг задлах чадвартай бөгөөд давхар судалтай ДНХ-ийн үр дүнтэй синтезийг зөвшөөрдөг.Гэсэн хэдий ч урт мРНХ-г загвар болгон ашиглах үед РНХ нь хугацаанаас нь өмнө задарч, cDNA-г таслахад хүргэдэг.Тиймээс хэрэв урт хуулбарыг нэгтгэхийг хүсч байвал cDNA клончлох үед RNaseH-ийн идэвхийг багасгах нь ихэвчлэн ашигтай байдаг.Үүний эсрэгээр, RNase H-ийн идэвхжилтэй урвуу транскриптазууд нь ПГУ-ын эхний мөчлөгийн үед РНХ-ДНХ-ийн дуплекс хайлалтыг сайжруулдаг тул qPCR програмуудад ихэвчлэн ашигтай байдаг.
Праймер дизайн
RT-qPCR-ийн qPCR алхамд ашигласан ПГУ-ын праймерууд нь экзон-эксон уулзварыг хамрахаар зохион бүтээгдсэн байх ёстой бөгөөд олшруулах праймер нь бодит экзон-интрон хил хязгаарыг дамжих боломжтой.Интрон агуулсан геномын ДНХ-ийн дарааллыг олшруулдаггүй тул энэхүү загвар нь геномын ДНХ-г бохирдуулахаас болж хуурамч эерэг үр дүнд хүрэх эрсдлийг бууруулдаг.
Хэрэв праймеруудыг экзон эсвэл экзон-эксоны хил хязгаарыг тусгаарлахаар төлөвлөх боломжгүй бол геномын ДНХ-ийн бохирдлыг арилгахын тулд РНХ дээжийг RNase-гүй DNase I эсвэл dsDNase-ээр эмчлэх шаардлагатай.
RT-qPCR хяналт
Урвуу транскрипцийн сөрөг хяналтыг (-RT хяналт) ДНХ-ийн бохирдлыг илрүүлэхийн тулд бүх RT-qPCR туршилтанд (жишээлбэл, өмнөх урвалын геномын ДНХ эсвэл ПГУ-ын бүтээгдэхүүн) оруулах ёстой.Энэхүү хяналт нь урвуу транскриптазаас бусад бүх урвалын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг агуулдаг.Энэ хяналтыг ашиглан урвуу транскрипц үүсэхгүй тул ПГУ-ын олшруулалт ажиглагдвал ДНХ-ээс бохирдох магадлал өндөр байна.
Шуудангийн цаг: 2022 оны 8-р сарын 02-ны өдөр
