qPCR туршилтын хувьд праймер дизайн нь маш чухал холбоос юм.Праймерууд тохиромжтой эсэх нь олшруулалтын үр ашиг нь стандартад хүрч байгаа эсэх, олшруулсан бүтээгдэхүүн нь өвөрмөц эсэх, туршилтын үр дүн байгаа эсэхтэй нягт холбоотой.
Тэгэхээр qPCR праймерын өвөрмөц байдлыг хэрхэн сайжруулах вэ?Өндөр өсгөлтийн үр ашиг?
Өнөөдөр бид таныг qPCR праймерыг хамтдаа зохион бүтээхэд хүргэж, qPCR праймер дизайныг туршилтын үр дүнтэй танин мэдэхүйн ур чадвар болгох болно.
qPCR праймерыг зохион бүтээхдээ ихэвчлэн дараах зүйлд анхаарлаа хандуулаарай: праймерыг аль болох интрон хөндлөн гаргах, бүтээгдэхүүний урт нь 100-300 bp, Tm утга нь 60°C-д аль болох ойр байх, дээд болон доод урсгалын праймерууд аль болох ойр байх, праймерын төгсгөл нь G эсвэл C байх ёстой гэх мэт.
1. Интроныг хамарсан праймеруудын дизайн
qPCR праймерыг зохион бүтээхдээ интроноор бүтээгдсэн праймеруудыг сонгох нь гДНХ-ийн загварыг олшруулахаас сэргийлж, бүтээгдэхүүнүүд нь бүгд cDNA-ийн олшруулалтаас гаралтай тул гДНХ-ийн бохирдлын нөлөөллийг арилгадаг.
2. Праймерын урт
Праймерын урт нь ерөнхийдөө 18-30 нт хооронд байх ба олшруулах бүтээгдэхүүний уртыг аль болох 100-300 bp хооронд хянах хэрэгтэй.
Хэрэв праймер хэтэрхий богино байвал энэ нь өвөрмөц бус олшруулалтад хүргэдэг бөгөөд хэрэв хэтэрхий урт байвал хоёрдогч бүтэц (үсний хавчаар бүтэц гэх мэт) амархан үүсдэг.Хэрэв олшруулах бүтээгдэхүүн хэт урт байвал полимеразын урвалд тохиромжгүй бөгөөд энэ нь ПГУ-ын олшруулалтын үр ашигт нөлөөлнө.
3. GC контент ба Tm утга
Праймерын GC агууламжийг 40% -иас 60% хүртэл хянах ёстой.Хэрэв энэ нь хэт өндөр эсвэл хэт бага байвал энэ нь урвалыг эхлүүлэхэд тохиромжгүй болно.Ижил Tm-ийн утга ба зөөлрүүлэх температурыг авахын тулд урагш ба урвуу праймеруудын GC агууламж ижил ойролцоо байх ёстой.
Tm-ийн утга нь аль болох 55-65°С, ерөнхийдөө 60°C орчим байх ба урсгалын дээд ба доод талын Tm-ийн утга нь аль болох ойр, болж өгвөл 4°С-ээс ихгүй байх ёстой.
4. Праймерын 3′ төгсгөлд А-г сонгохоос зайлсхий
Праймерын 3′ төгсгөл таарахгүй байвал янз бүрийн суурийн синтезийн үр ашигт ихээхэн ялгаатай байдаг.Сүүлчийн суурь нь А үед таарахгүй тохиолдолд ч гинжин нийлэгжилтийг эхлүүлж чаддаг ба сүүлийн суурь нь T үед таарахгүй индукцийн үр ашиг эрс буурдаг.Тиймээс праймерын 3′ төгсгөлд А-г сонгохоос зайлсхийхийг хичээгээрэй, T-г сонгох нь дээр.
Хэрэв энэ нь датчикийн праймер бол датчикийн 5′ төгсгөл нь G байж болохгүй, учир нь нэг G суурь нь FAM флюресцент сурвалжлагчийн бүлэгт холбогдсон байсан ч G нь FAM бүлгээс ялгарах флюресцент дохиог унтрааж, хуурамч сөрөг үр дүнд хүргэдэг.Харагдах.
5. Суурийн хуваарилалт
Праймер дахь дөрвөн суурийн тархалтыг санамсаргүй байдлаар хийвэл зохимжтой бөгөөд 3′-ийн төгсгөлд 3-аас илүү дараалсан G эсвэл C-ээс зайлсхийж, 3-аас дээш дараалсан байна.G эсвэл C нь GC-ээр баялаг дарааллын бүсэд хослол үүсгэхэд хялбар байдаг.
6. Праймер дизайны бүс нь нарийн төвөгтэй хоёрдогч бүтцээс зайлсхийх ёстой.
Олшруулах бүтээгдэхүүний нэг хэлхээнээс үүссэн хоёрдогч бүтэц нь ПГУ-ын жигд ахиц дэвшилд нөлөөлнө.Зорилтот дараалалд хоёрдогч бүтэц байгаа эсэхийг урьдчилан таамаглах замаар праймерын загварт энэ бүсээс зайлсхийхийг хичээ.
7. Праймерууд өөрсдөө болон праймеруудын хооронд дараалсан нэмэлт сууриудаас зайлсхийхийг хичээх хэрэгтэй.
Праймер өөрөө болон праймер хоёрын хооронд дараалсан 4 суурь нэмэлт байж болохгүй.Праймер нь өөрөө нэмэлт дараалалтай байх ёсгүй, эс тэгвээс үсний хавчаар бүтэц үүсгэхийн тулд өөрөө нугалж, праймер болон загвар хоёрын эвхэгддэг хослолд нөлөөлнө.
Дээд болон доод урсгалын праймеруудын хооронд нэмэлт дараалал байж болохгүй.Праймеруудын хоорондох нэмэлт нь праймер димерүүдийг үүсгэх бөгөөд энэ нь ПГУ-ын үр ашгийг бууруулж, тоон нарийвчлалд ч нөлөөлнө.Хэрэв праймер-димер ба үсний хавчаар бүтэц нь зайлшгүй байх ёстой бол △G-ийн утга хэт өндөр байх ёсгүй (4.5 ккал / моль-ээс бага байх ёстой).
8. Праймерууд нь зорилтот тодорхой бүтээгдэхүүнийг олшруулдаг.
qPCR илрүүлэх эцсийн зорилго нь зорилтот генийн элбэг дэлбэг байдлыг ойлгох явдал юм.Хэрэв өвөрмөц бус олшруулалт үүсвэл тоон үзүүлэлт буруу болно.Тиймээс праймеруудыг зохион бүтээсний дараа тэдгээрийг BLAST-аар турших шаардлагатай бөгөөд бүтээгдэхүүний өвөрмөц байдлыг дарааллын мэдээллийн санд харьцуулдаг.
Дараа нь бид хүний ​​GAS6 (Growth arrest specific 6) генийг qPCR праймерыг зохион бүтээх жишээ болгон авдаг.
01 асуулгын ген
Homo GAS6NCBI-ээр дамжуулан.Энд бид генийн нэр, төрлийг харьцуулж, тэдгээр нь нийцэж байгаа эсэхийг баталгаажуулах хэрэгтэй.
02 Генийн дарааллыг ол
(1) Хэрэв зорилтот дараалал нь геномын ДНХ бол эхнийхийг нь сонго, энэ нь генийн геномын ДНХ-ийн дараалал юм.
(2) Хэрэв зорилтот дараалал нь мРНХ бол хоёр дахь нь сонго.Оруулсаны дараа доорх хүснэгтийн "CDS" дээр дарна уу.Хүрэн дэвсгэр нь генийн кодлох дараалал юм.
03 Дизайн праймерууд
Primer-BLAST интерфейсийг оруулна уу
Зүүн дээд талд генийн дарааллын дугаар эсвэл дарааллыг Fasta форматаар оруулаад холбогдох параметрүүдийг бөглөнө үү.

"Праймер авах" дээр товшсоноор NCBI гарч ирэх бөгөөд ийм параметрийн сонголтыг бусад залгах хувилбаруудад нэмэгдүүлэх болно.Бид өөр өөр холбох хувилбаруудыг шалгаж, тохирох праймер хосыг авахын тулд илгээж болно (доорх зурагт үзүүлсэн шиг).Энэ процесс хэдэн арван секунд үргэлжилж магадгүй.
Эдгээр хос праймерын температур нь ойролцоогоор 60 ° C байна.Туршилтын зорилгын дагуу дунд зэргийн урттай, өвөрмөц чанар сайтай, өөрөө өөрийгөө нөхөх чадвар багатай праймеруудыг сонгоод амжилтын түвшин нэлээд өндөр байна!
04Праймерын өвөрмөц байдлын баталгаажуулалт
Үнэн хэрэгтээ, Primer-Blast нь праймерыг зохион бүтээхээс гадна бидний өөрсдөө зохион бүтээсэн праймеруудыг үнэлж чаддаг.Праймерын дизайны хуудас руу буцах, бидний зохион бүтээсэн дээд болон доод талын праймеруудыг оруулаад бусад параметрүүдийг тохируулахгүй.Илгээсний дараа хос праймер бусад генүүд дээр байгаа эсэхийг харах боломжтой.Хэрэв эдгээрийг бүгдийг нь өсгөхийг хүсч буй ген дээр харуулсан бол энэ хос праймерын өвөрмөц чанар маш сайн байгааг харуулж байна!(Жишээ нь, энэ нь үндсэн асуулгын цорын ганц үр дүн юм!)

05 Праймерын чанарын дүгнэлт
"Стандарт хүртэл өсгөх үр ашиг", "олшруулсан бүтээгдэхүүний шинж чанар", "туршилтын найдвартай үр дүн" -ийг хослуулсан "төгс" праймер нь ямар төрлийн праймер вэ?
Олшруулах үр ашиг

хайлах муруй
Праймеруудын олшруулалтын үр ашиг 90%-110%-д хүрдэг нь олшруулалтын үр ашиг сайн, хайлах муруй нь нэг оргил бөгөөд ихэвчлэн Tm>80°C байдаг нь олшруулах өвөрмөц чанар сайн гэсэн үг юм.
 
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
Бодит цагийн PCR Easy–SYBR GREEN I
Бодит цагийн PCR Easy-Taqman