Молекулын оношлогооны технологи нь молекул биологийн аргуудыг ашиглан хүний ​​биеийн генетикийн материалын илэрхийлэл, бүтцийг илрүүлж, янз бүрийн эмгэг төрүүлэгчдийг илрүүлж, өвчнийг урьдчилан таамаглах, оношлох зорилгод хүрдэг.

Сүүлийн жилүүдэд молекул оношилгооны технологи шинэчлэгдэж, давтагдсанаар молекул оношилгооны эмнэлзүйн хэрэглээ улам бүр өргөн хүрээтэй, гүнзгий болж, молекул оношилгооны зах зээл эрчимтэй хөгжлийн үе шатанд орж байна.

Зохиогч зах зээлд түгээмэл хэрэглэгддэг молекулын оношлогооны технологиудыг нэгтгэн дүгнэж, эхний хэсэгт ПГУ-ын технологи, хоёрдугаар хэсэгт нуклейн хүчлийн изотерм олшруулалтын технологийг, хоёрдугаар хэсэгт дараалал тогтоох технологийг танилцуулсан байна.

01

I хэсэг: ПГУ-ын технологи

ПГУ-ын технологи

ПГУ (полимеразын гинжин урвал) нь 30 гаруй жилийн түүхтэй, in vitro ДНХ олшруулах технологийн нэг юм.

ПГУ-ын технологийг 1983 онд АНУ-ын Сетусын Кари Муллис анхлан нэвтрүүлсэн.Муллис 1985 онд ПГУ-ын патент авах хүсэлт гаргасан бөгөөд тэр жилдээ Шинжлэх ухааны тухай ПГУ-ын анхны эрдэм шинжилгээний өгүүлэл нийтлүүлсэн.Муллис 1993 онд химийн салбарт Нобелийн шагнал хүртсэн.

ПГУ-ын үндсэн зарчмууд

ПГУ нь зорилтот ДНХ-ийн хэсгүүдийг нэг сая гаруй удаа өсгөж чаддаг.Энэ зарчим нь ДНХ полимеразын катализын дор эх хэлхээ ДНХ-ийг загвар болгон ашигладаг бөгөөд тодорхой праймерыг өргөтгөх эхлэлийн цэг болгон ашигладаг.Энэ нь денатураци, анялах, сунгах зэрэг үе шатуудаар in vitro-д хуулбарлагддаг.ДНХ-ийн эх хэлхээний загварт нэмэлт охин хэлхээний ДНХ-ийн үйл явц.

Стандарт ПГУ-ын процесс нь гурван үе шатанд хуваагдана.

1. Денатураци: ДНХ-ийн давхар хэлхээг салгахын тулд өндөр температур ашиглана.ДНХ-ийн давхар хэлхээ хоорондын устөрөгчийн холбоо нь өндөр температурт (93-98 ° C) тасардаг.

2. Нэвчилт: Давхар хэлхээтэй ДНХ-г салгасны дараа температурыг бууруулж, праймер нь нэг хэлхээтэй ДНХ-тэй холбогдоно.

3. Өргөтгөл: ДНХ полимераз нь температур буурах үед холбогдсон праймеруудаас ДНХ-ийн хэлхээний дагуу нэмэлт хэлхээг нэгтгэж эхэлдэг.Өргөтгөл дууссаны дараа мөчлөг дуусч, ДНХ-ийн хэсгүүдийн тоо хоёр дахин нэмэгддэг.

Эдгээр гурван алхмыг 25-35 удаа давтах нь ДНХ-ийн хэлтэрхийний тоо огцом нэмэгдэх болно.

ПГУ-ын авъяас чадвар нь өөр өөр зорилтот генүүдэд зориулж өөр өөр праймеруудыг зохион бүтээх боломжтой бөгөөд ингэснээр зорилтот генийн хэсгүүдийг богино хугацаанд олшруулах боломжтой байдаг.

Одоогийн байдлаар ПГУ-ыг энгийн ПГУ, флюресцент тоон ПГУ, дижитал ПГУ гэж гурван төрөлд хувааж болно.

Энгийн ПГУ-ын эхний үе

Зорилтот генийг олшруулахын тулд энгийн ПГУ-ын олшруулалтын хэрэгслийг ашиглан бүтээгдэхүүнийг илрүүлэхийн тулд агароз гель электрофорез ашиглан зөвхөн чанарын шинжилгээ хийх боломжтой.

Эхний үеийн ПГУ-ын гол сул талууд:

-Өвөрмөц бус өсгөлт, хуурамч эерэг үр дүнд өртөмтгий.

-Илрүүлэх ажиллагаа удаан, хагалгаа нь нүсэр болдог.

-Зөвхөн чанарын шинжилгээ хийх боломжтой.

Хоёр дахь үеийн флюресценцийн тоон ПГУ

Флюресценцийн тоон ПГУ (Бодит цагийн ПГУ) нь qPCR гэгддэг бөгөөд урвалын системийн явцыг илтгэх флюресцент датчикуудыг нэмж флюресцент дохионы хуримтлалаар дамжуулан олшруулсан бүтээгдэхүүний хуримтлалыг хянах, флюресцентийн муруйгаар үр дүнг шүүж, C хэмжигдэхүүн болон стандарт утгын тусламжтайгаар үүнийг тодорхойлоход ашигладаг.

qPCR технологи нь хаалттай системд явагддаг тул бохирдох магадлал багасч, флюресценцийн дохиог хянаж тоон илрүүлэх боломжтой байдаг тул эмнэлзүйн практикт хамгийн өргөн хэрэглэгдэж, ПГУ-ын зонхилох технологи болоод байна.

Бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ-д ашигладаг флюресцент бодисуудыг дараах байдлаар хувааж болно: TaqMan флюресцент датчик, молекул дохиолол, флюресцент будаг.

1) TaqMan флюресцент датчик:

ПГУ-ын олшруулалтын явцад хос праймер нэмэхийн зэрэгцээ тусгай флюресцент датчик нэмнэ.Уг датчик нь олигонуклеотид бөгөөд хоёр үзүүрийг сурвалжлагч флюресцент бүлэг болон унтраагч флюресцент бүлэг гэж тэмдэглэсэн байна.

Сорьц бүрэн бүтэн байх үед сурвалжлагчийн бүлгээс ялгарах флюресцент дохио нь бөхөөх бүлэгт шингэдэг;ПГУ-ын олшруулалтын явцад Taq ферментийн 5′-3′ экзонуклеазын идэвхжил нь датчикийг задалж, доройтуулж, сурвалжлагч флюресцент бүлэг ба унтрагч болгодог бөгөөд ингэснээр флюресцентийн хяналтын систем нь флюресценцийн дохиог хүлээн авах боломжтой, өөрөөр хэлбэл ДНХ-ийн хэлхээ олшрох бүрт томуу, томуу, томуу, томуу үүсэх, дохио нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүн үүсэхтэй бүрэн синхрончлогддог.

2) SYBR флюресцент будаг:

ПГУ-ын урвалын системд SYBR флюресцент будгийг илүүдэл хэмжээгээр нэмнэ.SYBR флюресцент будгийг ДНХ-ийн давхар хэлхээнд тусгайлан оруулсны дараа флюресцент дохиог ялгаруулдаг.Гинжинд ороогүй SYBR будгийн молекул нь флюресцент дохиог гаргахгүй бөгөөд ингэснээр флюресцент дохиог баталгаажуулна. ПГУ-ын бүтээгдэхүүний өсөлт нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний өсөлттэй бүрэн синхрончлогддог.SYBR нь зөвхөн хоёр хэлхээтэй ДНХ-тэй холбогддог тул хайлах муруйг ашиглан ПГУ-ын урвал өвөрмөц эсэхийг тодорхойлох боломжтой.

3) Молекулын дохио

Энэ нь ишний гогцоотой давхар шошготой олигонуклеотид датчик бөгөөд 5 ба 3 төгсгөлд ойролцоогоор 8 суурьтай үсний хавчаар үүсгэдэг.Хоёр төгсгөлд байгаа нуклейн хүчлийн дараалал нь харилцан бие биенээ хосолсон байдаг бөгөөд энэ нь флюресцент бүлэг болон бөхөөх бүлгийг нягт болгодог.Хаах нь флюресцент үүсгэхгүй.

ПГУ-ын бүтээгдэхүүн үүссэний дараа, анивчих процессын явцад молекулын гэрлийн дунд хэсгийг тодорхой ДНХ-ийн дараалалтай хослуулж, флюресцент генийг унтраагч генээс салгаж, флюресцент үүсгэдэг.

Хоёр дахь үеийн ПГУ-ын гол сул талууд:

Мэдрэмж дутмаг хэвээр байгаа бөгөөд бага хуулбартай сорьцыг илрүүлэх нь үнэн зөв биш юм.

Арын үнэ цэнийн нөлөөлөл байдаг бөгөөд үр дүн нь хөндлөнгийн оролцоонд өртөмтгий байдаг.

Гурав дахь үеийн дижитал ПГУ

Дижитал ПГУ (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) нь эцсийн цэг илрүүлэх замаар зорилтот дарааллын хуулбарын дугаарыг тооцоолж, дотоод хяналт, стандарт муруйг ашиглахгүйгээр үнэн зөв үнэмлэхүй тоон илрүүлэлтийг хийх боломжтой.

Дижитал ПГУ нь төгсгөлийн цэг илрүүлэх аргыг ашигладаг бөгөөд Ct-ийн утгаас (мөчлөгийн босго) хамаардаггүй тул дижитал ПГУ-ын урвал нь олшруулалтын үр ашгийн нөлөөнд бага өртөж, ПГУ-ын урвалын дарангуйлагчдын хүлцэл сайжирч, өндөр нарийвчлалтай, давтагдах боломжтой.

Өндөр мэдрэмжтэй, өндөр нарийвчлалтай тул ПГУ-ын урвал дарангуйлагчийн нөлөөнд амархан өртдөггүй бөгөөд стандарт бүтээгдэхүүнгүйгээр жинхэнэ үнэмлэхүй хэмжигдэхүүнийг гаргаж чаддаг нь судалгаа, хэрэглээний халуун цэг болсон.

Урвалын нэгжийн янз бүрийн хэлбэрийн дагуу үүнийг микрофлюидик, чип, дуслын систем гэж гурван төрөлд хувааж болно.