Ct утга нь флюресцент тоон ПГУ-ын үр дүнг харуулах хамгийн чухал хэлбэр юм.Энэ нь генийн илэрхийллийн ялгаа эсвэл генийн хуулбарын тоог тооцоолоход хэрэглэгддэг.Тэгэхээр флюресценцийн хэмжилтийн Ct утга нь ямар үндэслэлтэй гэж тооцогддог вэ?Ct утгын үр дүнтэй хүрээг хэрхэн хангах вэ?

Ct утга гэж юу вэ?
qPCR олшруулах процессын үед олшруулсан бүтээгдэхүүний флюресценцийн дохио нь тогтоосон флюресценцийн босгонд хүрэх үед олшруулах мөчлөгийн харгалзах тоо (Циклийн босго).C нь Cycle, T нь Threshold гэсэн үг.Энгийнээр хэлэхэд Ct утга нь анхны загвар олшруулалт нь qPCR-д тодорхой хэмжээний бүтээгдэхүүнд хүрэхэд тохирох мөчлөгийн тоо юм."Тодорхой хэмжээний бүтээгдэхүүн" гэж нэрлэгддэг зүйлийг дараа нь дэлгэрэнгүй тайлбарлах болно.

Ct утга нь юу хийдэг вэ?

1. Экспоненциал олшруулалт, загварын хэмжээ болон Ct утгын хоорондын хамаарал
Хамгийн тохиромжтой нь qPCR дахь генүүд нь тодорхой тооны мөчлөгийн дараа экспоненциал олшруулалтаар хуримтлагддаг.Олшруулах мөчлөгийн тоо болон бүтээгдэхүүний хэмжээ хоорондын хамаарал нь: Олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээ = анхны загварын хэмжээ × (1+En) мөчлөгийн тоо.Гэсэн хэдий ч qPCR урвал нь үргэлж тохиромжтой нөхцөлд байдаггүй.Олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээ "тодорхой бүтээгдэхүүний хэмжээ"-д хүрэх үед энэ үеийн мөчлөгийн тоо нь Ct утга бөгөөд энэ нь экспоненциал олшруулах хугацаанд байна.Ct утга ба загварын эхлэлийн хэмжээ хоёрын хоорондын хамаарал: Загварын Ct утга болон загварын эхлэлийн хуулбарын дугаарын логарифмын хооронд шугаман хамаарал байна.Загварын анхны концентраци өндөр байх тусам Ct утга бага байх болно;Загварын анхны концентраци бага байх тусам Ct утга их болно.

2. Олшруулах муруй, флюресценцийн босго болон ПГУ-ын тодорхой хэмжээний бүтээгдэхүүний хэмжээ
qPCR олшруулах бүтээгдэхүүний хэмжээг флюресцент дохио, өөрөөр хэлбэл олшруулалтын муруй хэлбэрээр шууд харуулна.ПГУ-ын эхний шатанд олшруулалт нь хамгийн тохиромжтой нөхцөлд явагддаг, мөчлөгийн тоо бага, бүтээгдэхүүний хуримтлал бага, флюресценцийн түвшинг флюресценцийн дэвсгэрээс тодорхой ялгах боломжгүй байдаг.Үүний дараа флюресцент нэмэгдэж, экспоненциал үе шатанд ордог.ПГУ-ын урвал дөнгөж экспоненциал шатандаа орох үед тодорхой цэгт ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээг илрүүлж, үүнийг "тодорхой хэмжээний бүтээгдэхүүн" болгон ашиглаж болох бөгөөд үүнээс загварын анхны агуулгыг гаргаж болно.Тиймээс тодорхой хэмжээний бүтээгдэхүүнд тохирох флюресценцийн дохионы эрч хүч нь флюресценцийн босго юм.

ПГУ-ын хожуу үе шатанд олшруулалтын муруй нь экспоненциал олшруулалтыг харуулахаа больж, шугаман үе ба тэгш өндөрлөгийн үе шатанд ордог.

3.Ct утгыг давтах чадвар
ПГУ-ын мөчлөг нь Ct утгын мөчлөгийн дугаарт хүрэхэд энэ нь жинхэнэ экспоненциал олшруулалтын үе рүү дөнгөж орсон байна.Энэ үед жижиг алдаа нь олшруулагдаагүй байгаа тул Ct утгын давтагдах чадвар маш сайн, өөрөөр хэлбэл нэг загвар нь өөр өөр цаг үед эсвэл өөр өөр хоолойд нэгэн зэрэг олширч байна.Олшруулалт, олж авсан Ct утга нь тогтмол байна.

1.Өсгөх үр ашиг En
ПГУ-ын олшруулалтын үр ашиг гэдэг нь полимераз нь олшруулах генийг ампликон болгон хувиргах үр ашгийг илэрхийлдэг.Нэг ДНХ молекулыг хоёр ДНХ молекул болгон хувиргах үед олшруулах үр ашиг 100% байна.Олшруулах үр ашгийг ихэвчлэн En гэж илэрхийлдэг.Дараагийн өгүүллүүдийн дүн шинжилгээг хөнгөвчлөхийн тулд олшруулалтын үр ашигт нөлөөлж буй хүчин зүйлсийг товч танилцуулав.

2.Ct утгын хүрээ
Ct утгууд 15-35 хооронд хэлбэлздэг.Хэрэв Ct-ийн утга 15-аас бага бол олшруулалт нь суурь үеийн хязгаарт байгаа бөгөөд флюресценцийн босго хүрээгүй гэж үзнэ.Хамгийн тохиромжтой нь Ct утга ба загварын анхны хуулбарын дугаарын логарифм, өөрөөр хэлбэл стандарт муруй хоёрын хооронд шугаман хамаарал байдаг.Стандарт муруйгаар дамжуулан олшруулалтын үр ашиг 100% байх үед генийн нэг хуулбарын тоог тодорхойлох Ct-ийн тооцоолсон утга нь 35 орчим байна. Хэрэв 35-аас их бол загварын анхны хуулбарын тоо онолын хувьд 1-ээс бага бөгөөд энэ нь утгагүй гэж үзэж болно.

Төрөл бүрийн генийн Ct мужуудын хувьд генийн хуулбарын тоо, олшруулалтын үр ашгийн зөрүүгээс шалтгаалан генийн стандарт муруйг гаргаж, генийн шугаман илрүүлэх хүрээг тооцоолох шаардлагатай.

3.Ct утгын нөлөөлөх хүчин зүйлс
Олшруулах мөчлөгийн тоо болон бүтээгдэхүүний хэмжээ хоорондын хамаарлаас: олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээ = анхны загварын хэмжээ × (1+En) мөчлөгийн тоо, хамгийн тохиромжтой нөхцөлд анхны загвар ба En-ийн хэмжээ нь Ct-ийн утгад сөргөөр нөлөөлнө гэдгийг харж болно.Загварын чанар эсвэл олшруулалтын үр ашгийн ялгаа нь Ct утгыг хэт том эсвэл хэт бага болгоход хүргэдэг.

4.Ct утга нь хэт том эсвэл хэт бага байна