ПГУ нь нуклейн хүчлийг олшруулах хамгийн өргөн хэрэглэгддэг технологи бөгөөд мэдрэмж, өвөрмөц чанараараа өргөн хэрэглэгддэг.Гэсэн хэдий ч ПГУ нь дулааны денатурацийг олон удаа шаарддаг бөгөөд багаж хэрэгсэл, тоног төхөөрөмжид найдах хязгаарлалтаас салж чадахгүй бөгөөд энэ нь эмнэлзүйн хээрийн туршилтанд хэрэглэх боломжийг хязгаарладаг.

1990-ээд оны эхэн үеэс эхлэн олон лабораториуд дулааны денатураци шаарддаггүй тогтмол температурыг өсгөх технологийг боловсруулж эхэлсэн.Одоо тэд гогцоонд зуучлагдсан изотерм олшруулах технологи, хэлхээ солих изотерм олшруулах технологи, гулсмал тойрог изотерм олшруулах технологи, нуклейн хүчлийн дарааллын хамаарлыг боловсруулсан.Изотерм олшруулах технологи болон бусад технологи. 

Loop-зуучлагдсан изотермийн олшруулалт

Олшруулах зарчим нь ДНХ нь ойролцоогоор 65°С-д динамик тэнцвэрт байдалд байх явдал дээр суурилдаг.Аливаа праймер суурь хосолж, давхар судалтай ДНХ-ийн нэмэлт хэсэг рүү тэлэх үед нөгөө хэлхээ нь салж, нэг судалтай болно.

Энэ температурт ДНХ нь хэлхээ-шилжилттэй ДНХ-ийн нийлэгжилтийг тасралтгүй өөрөө эргэлдүүлэхийн тулд хэлхээ-шилжилттэй ДНХ-ийн полимеразад тулгуурлан 4 тусгай праймерыг ашигладаг.

Эхлээд зорилтот генийн F3, F2, F1, B1, B2, B3 гэсэн 6 тодорхой бүс нутгийг тодорхойлж, дараа нь эдгээр 6 тодорхой бүс нутагт үндэслэн 4 праймерыг зохион бүтээ (доорх зурагт үзүүлсэн шиг):

Урд талын дотоод праймер (FIP) нь F1c ба F2-ээс бүрдэнэ.

Буцах дотоод праймер (BIP) нь B1c ба B2-ээс бүрдэх ба TTTT-ийг дунд хэсэгт зайлагч болгон ашигладаг.

F3 ба B3 гаднах праймерууд нь зорилтот генийн F3 ба B3 хэсгээс бүрддэг.

LAMP урвалын системд дотоод праймерын концентраци нь гаднах праймераас хэд дахин их байдаг.Дотоод праймерыг эхлээд загвар хэлхээтэй нэгтгэж, нэмэлт хэлхээг нэгтгэж, ДНХ-ийн давхар хэлхээ үүсгэдэг.Дараа нь гаднах праймер нь загвар хэлхээтэй нийлж ДНХ-ийн давхар хэлхээ үүсгэдэг.BstDNA полимеразын нөлөөн дор дотоод праймераар нийлэгжсэн нэмэлт хэлхээ ялгардаг.Хэд хэдэн урвалын дараа нэмэлт хэлхээ нь дамббелл бүтэцтэй нэг ДНХ-ийн хэлхээ үүсгэдэг.

Дамббеллийн бүтэц ДНХ-ийн нэг хэлхээ нь өөрөө нээлттэй төгсгөлтэй шилжилтийн иш-гогцооны бүтцийн ДНХ-ийг тасралтгүй үүсгэх загвар болгон ашигладаг.Дотор болон гадна талын праймерууд нь шилжилтийн иш-гогцооны бүтцийн ДНХ-ийг хэлхээний шилжилт, сунгалтын урвалыг тасралтгүй явуулахад чиглүүлж, эцэст нь янз бүрийн урттай олон ишний гогцооны бүтцийг үүсгэдэг.ДНХ-ийн холимог.

Давтамж ба сул тал нь гогцоонд суурилсан изотерм олшруулалт

LAMP-ийн давуу талууд:

(1) 1 цагийн дотор зорилтот генийн 1-10 хувийг үр дүнтэй өсгөж чадах өндөр өсгөлтийн үр ашиг, олшруулах үр ашиг нь энгийн ПГУ-аас 10-100 дахин их байдаг.

(2) Урвалын хугацаа богино, өвөрмөц чанар нь хүчтэй, тусгай тоног төхөөрөмж шаарддаггүй.

LAMP-ийн дутагдал:

(1) Праймеруудад тавигдах шаардлага ялангуяа өндөр байдаг.

(2) Олшруулсан бүтээгдэхүүнийг хувилах, дараалал тогтооход ашиглах боломжгүй, зөвхөн дүгнэлт хийхэд ашиглах боломжтой.

(3) Хүчтэй мэдрэмтгий тул аэрозоль үүсгэхэд хялбар бөгөөд хуурамч эерэг үр дүнд хүргэж, туршилтын үр дүнд нөлөөлдөг.

Sтрандын шилжилтийн олшруулалт

Strand displacement amplification (SDA) нь 1992 онд Америкийн эрдэмтэн Уокерын анх санал болгосон ферментийн урвалд суурилсан in vitro изотерм ДНХ-ийн олшруулах арга юм.

SDA-ийн үндсэн системд хязгаарлалтын эндонуклеаза, хэлхээний шилжилт хөдөлгөөн бүхий ДНХ полимераз, хоёр хос праймер, dNTP, кальци, магнийн ион ба буфер систем орно.

Туузны шилжилтийн олшруулалтын зарчим нь зорилтот ДНХ-ийн хоёр төгсгөлд химийн аргаар өөрчлөгдсөн хязгаарлалтын эндонуклеазыг таних дараалалд суурилдаг.Эндонуклеаз нь ДНХ-ийн хэлхээний цоорхойг таних цэг дээр нээж, ДНХ полимераз нь цоорхойг 3′ сунгаж, дараагийн ДНХ-ийн хэлхээг орлуулдаг.

Солигдсон ДНХ-ийн нэг хэлхээг праймеруудтай нэгтгэж, ДНХ полимеразын тусламжтайгаар давхар хэлхээ болгон сунгаж болно.Энэ үйл явц тасралтгүй давтагддаг бөгөөд ингэснээр зорилтот дарааллыг үр дүнтэйгээр нэмэгдүүлэх болно.

Туузны шилжилтийн олшруулалтын технологийн давуу болон сул талууд

SDA-ийн давуу талууд:

Олшруулалтын үр ашиг өндөр, урвалын хугацаа богино, өвөрмөц чанар нь хүчтэй, тусгай тоног төхөөрөмж шаарддаггүй.

SDA-ийн сул талууд:

Бүтээгдэхүүн нь жигд биш, зарим нэг болон хоёр судалтай бүтээгдэхүүн нь SDA мөчлөгт үргэлж үйлдвэрлэгддэг бөгөөд электрофорезоор илрүүлэх үед хаягдал үүсэх нь гарцаагүй.

Rоллинг тойргийн олшруулалт

Өнхрөх тойрог олшруулах (RCA) нь эмгэг төрүүлэгч организмаас ДНХ-г эргүүлэх аргаар хуулбарлах аргыг ашиглах замаар санал болгож байна.Энэ нь нэг судалтай дугуй ДНХ-ийг тогтмол температурт загвар болгон ашиглахыг хэлдэг ба тусгай ДНХ полимераз (Phi29 гэх мэт) ) ДНХ-ийн нийлэгжилтийн эргэлтийн тойргийн үйл ажиллагааны дор зорилтот генийг олшруулахад хүрдэг.

RCA нь шугаман олшруулалт ба экспоненциал олшруулалтад хуваагдаж болно.Шугаман RCA-ийн үр ашиг 10 хүрч болно⁵удаа, экспоненциал RCA-ийн үр ашиг 10 хүрч болно⁹удаа.

Доорх зурагт үзүүлсэн шиг энгийн ялгаа, шугаман олшруулалт a нь зөвхөн 1 праймер, экспоненциал олшруулалт b нь 2 праймертай.

Шугаман RCA-г мөн нэг праймер RCA гэж нэрлэдэг.Праймер нь дугуй хэлбэртэй ДНХ-тэй холбогддог ба ДНХ полимеразын нөлөөгөөр сунгагддаг.Бүтээгдэхүүн нь нэг гогцооны уртаас хэдэн мянга дахин их олон тооны давтагдах дараалал бүхий шугаман нэг утас юм.

Шугаман RCA-ийн бүтээгдэхүүн нь үргэлж гарааны праймертай холбогддог тул дохиог хялбархан бэхлэх нь гол давуу тал юм.

Экспоненциал RCA буюу Hyper brased amplification HRCA (Hyper branched RCA) нь экспоненциал RCA-д нэг праймер нь RCA бүтээгдэхүүнийг өсгөж, хоёр дахь праймер нь RCA бүтээгдэхүүнтэй эрлийзжэж, сунадаг ба орлуулах нь RCA бүтээгдэхүүнтэй аль хэдийн холбогдсон байна.

Нуклейн хүчлийн олшруулалтын дугуйны давуу болон сул талууд

RCA-ийн давуу талууд:

Өндөр мэдрэмжтэй, сайн өвөрмөц, хялбар ажиллагаатай.

RCA-ийн сул талууд:

Дохио илрүүлэх үеийн суурь асуудлууд.RCA урвалын үед эргэлтгүй цоожны датчик болон холбогдоогүй датчикийн загвар ДНХ эсвэл РНХ нь зарим дэвсгэр дохиог үүсгэж болно. 

Nucleicacid дараалалд суурилсан олшруулалт

Нуклейн хүчлийн дараалалд суурилсан олшруулалт (NASBA) нь ПГУ-ын үндсэн дээр боловсруулсан шинэ технологи юм.Энэ нь T7 дэмжигч дараалал бүхий хос праймераар удирддаг нуклейн хүчлийн тасралтгүй ба изотермаль олшруулалт юм.Энэхүү технологи нь загвар РНХ-ийг 2 цаг орчим хугацаанд ойролцоогоор 109 дахин өсгөх боломжтой бөгөөд энэ нь ердийн ПГУ-ын аргаас 1000 дахин өндөр бөгөөд тусгай төхөөрөмж шаарддаггүй.

Энэхүү технологийг өвчин гарсан даруйдаа хурдан оношлоход ашиглаж ирсэн бөгөөд одоогоор олон компани РНХ илрүүлэх иж бүрдэлд энэ аргыг ашиглаж байна.

Хэдийгээр РНХ-ийн олшруулалт нь урвуу транскрипцийн ПГУ-ын технологийг ашиглах боломжтой ч NASBA нь өөрийн гэсэн давуу талтай: харьцангуй тогтмол температурын нөхцөлд хийгдэх боломжтой бөгөөд уламжлалт ПГУ-ын технологиос илүү тогтвортой, үнэн зөв байдаг.

Урвал нь 41 градус Цельсийн температурт явагддаг бөгөөд дуусгахын тулд AMV (шувууны миелобластозын вирус) урвуу транскриптаза, RNase H, T7 РНХ полимераза болон хос праймер шаардлагатай.

Процесс нь үндсэндээ дараахь зүйлийг агуулна.

Урд талын праймер нь T7 дэмжигчийн нэмэлт дарааллыг агуулдаг.Урвалын явцад урагшлах праймер нь РНХ-ийн хэлхээтэй холбогдож, AMV ферментээр катализатор болж ДНХ-РНХ-ийн давхар хэлхээ үүсгэдэг.

RNase H нь эрлийз хоёр хэлхээт РНХ-г шингээж, нэг судалтай ДНХ-г хадгалдаг.

Урвуу праймер ба AMV ферментийн үйл ажиллагааны дор T7 промотерийн дарааллыг агуулсан ДНХ-ийн давхар хэлхээ үүсдэг.

T7 РНХ полимеразын нөлөөгөөр транскрипцийн процесс дуусч, зорилтот РНХ их хэмжээгээр үүсдэг.

NASBA-ийн давуу талууд:

(1) Түүний праймер нь T7 промоторын дараалалтай боловч гадаад давхар судалтай ДНХ нь T7 промоторын дараалалгүй бөгөөд олшруулах боломжгүй тул энэ технологи нь өндөр өвөрмөц, мэдрэмжтэй байдаг.

(2) NASBA нь урвуу транскрипцийн процессыг олшруулах урвалд шууд оруулж, урвалын хугацааг богиносгодог.

NASBA-ийн сул талууд:

(1) Урвалын бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь илүү төвөгтэй байдаг.

(2) Урвалын өртөгийг нэмэгдүүлэхийн тулд гурван төрлийн фермент шаардлагатай.