ПГУ, олон ПГУ, In situ ПГУ, Урвуу ПГУ, RT-ПГУ, qPCR（1）–ПГУ

Бид янз бүрийн ПГУ-ын үзэл баримтлал, үе шат, нарийн ширийн зүйлийг ялгах болно

Ⅰ. ПГУ

ПГУ гэж нэрлэгддэг полимеразын гинжин урвал нь ДНХ-ийн тодорхой хэсгүүдийг томруулахад ашигладаг молекул биологийн технологи юм.Үүнийг in vitro ДНХ-ийн тусгай хуулбар гэж үзэж болно.ДНХ полимераза (ДНХ Полимераз I) аль эрт 1955 онд, туршилтын үнэ цэнэ, практик ач холбогдолтой E. Coli-ийн Кленовын фрагментийг 1970-аад оны эхээр доктор Х.Кленоу нээсэн боловч энэ фермент температурыг тэсвэрлэдэггүй тул өндөр температур нь түүнийг доройтуулж болзошгүй тул өндөр температурын задралын урвалд ордоггүй.Өнөө үед ашиглагдаж буй ферментүүдийг (Taq полимераза гэж нэрлэдэг) 1976 онд халуун рашааны нян Thermus aquaticus-аас тусгаарласан. Түүний онцлог нь өндөр температурыг тэсвэрлэх чадвартай, хамгийн тохиромжтой фермент боловч 1980-аад оноос хойш өргөн хэрэглэгддэг.ПГУ-ын анхны анхдагч прототипийн анхны үзэл баримтлал нь генийн засвар, хуулбарлахтай төстэй бөгөөд үүнийг 1971 онд доктор КЖелл Клеппе санал болгосон. Тэрээр анхны энгийн бөгөөд богино хугацааны генийн хуулбарыг хэвлүүлсэн (ПГУ-ын эхний хоёр мөчлөгийн урвалтай төстэй).Өнөөдөр боловсруулсан ПГУ-ыг 1983 онд Доктор Кари Б.Муллис боловсруулсан. Доктор Муллис тэр жил PE компаниудад үйлчилж байсан тул PE нь ПГУ-ын салбарт онцгой байр суурь эзэлдэг.Доктор Муллис 1985 онд Сайки болон бусад хүмүүстэй холбоотой анхны нийтлэлийг албан ёсоор хэвлүүлсэн. Тэр цагаас хойш ПГУ-ын хэрэглээ өдөрт хэдэн мянган миль болсон бөгөөд холбогдох баримт бичгийн чанар нь бусад олон судалгааны аргуудыг тааламжгүй болгосон гэж хэлж болно.Улмаар ПГУ-ын технологи нь биологийн шинжлэх ухааны судалгаа, эмнэлзүйн хэрэглээнд өргөн хэрэглэгдэж, молекул биологийн судалгааны хамгийн чухал технологи болжээ.Муллис мөн 1993 онд химийн салбарт Нобелийн шагнал хүртсэн.

ПГУзарчим

ПГУ-ын технологийн үндсэн зарчим нь ДНХ-ийн байгалийн хуулбарлах үйл явцтай төстэй бөгөөд түүний өвөрмөц байдал нь зорилтот дарааллын хоёр төгсгөлд нэмэлт болох олигонуклеотидын праймераас хамаардаг.ПГУ нь доройтол-эрэвшүүлэх-өргөтгөх гурван үндсэн урвалын үе шатаас бүрдэнэ: ①Загварын ДНХ-ийн доройтол: Загварын ДНХ-г тодорхой хугацаанд 93°C орчим халаасны дараа ДНХ-ийн хос ДНХ-ийн уусмал нь загвар ДНХ-ийн ПГУ-ын олшруулалтын үр дүнд үүссэн ДНХ-ийн хос ДНХ-ийн уусмалыг дараагийн гинжин хэлхээнд бэлтгэж, нэг гинжин хэлхээтэй болгоно. дугуй урвал.②Загвар ДНХ ба праймерыг задлах (нэгдмэл): Загвар ДНХ-г халааж, нэг гинжин хэлхээнд задруулсны дараа температур ойролцоогоор 55°C хүртэл буурдаг.Праймер ба загвар ДНХ-ийн нэг гинжин хэлхээний нэмэлт дараалал.③Праймерын өргөтгөл: ДНХ загвар-праймерын холболт нь урвалын түүхий эд болох dNTP бүхий TaqDNA полимеразын үйлчлэлд суурилдаг.Хуулбарлах зарчмыг баримталж, загвар ДНХ-ийн гинжийг нөхөх шинэ хагас нөөцлөгдсөн хуулбарын гинжийг нэгтгэж, мөчлөгийн доройтол-эрэвшүүлэх-өргөтгөл гурван процессыг давтах нь илүү их "хагас нөөцлөгдсөн хуулбарын гинж" авах боломжтой бөгөөд энэ шинэ хэлхээг дахин ашиглах боломжтой Дараагийн мөчлөгийн загвар болоорой.Гогцоог дуусгахад 2-4 минут шаардлагатай бөгөөд зорилтот генийг 2-3 цагийн дотор хэдэн сая удаа өсгөх боломжтой.

СтандартПГУУрвалын систем

ПГУ-ын урвалын таван элемент

ПГУ-ын урвалд праймер, фермент, dNTP, загвар, буфер (Mg2+ шаардлагатай) гэсэн үндсэндээ таван төрлийн бодис оролцдог.[ПГУ-ын процедур]

Стандарт ПГУ-ын процесс нь гурван үе шатанд хуваагдана

1. ДНХ-ийн доройтол (90°C-96°C): Дулааны нөлөөгөөр хос гинжин ДНХ-ийн загварууд, устөрөгчийн холбоо тасарч, нэг гинжин ДНХ үүсгэдэг.

2. Хатаах (25℃ -65℃): Системийн температур буурч, праймерыг ДНХ-ийн загвартай нэгтгэж, орон нутгийн хос хэлхээ үүсгэдэг.

3. Өргөтгөл (70℃ -75℃): Taq ферментийн нөлөөн дор (ойролцоогоор 72°C, хамгийн сайн үйл ажиллагаа) dNTP-ийг түүхий эд болгон ашигладаг бөгөөд праймерын 5′ төгсгөлөөс → 3′ төгсгөл хүртэл үргэлжилдэг, синтез болон загвар нь ДНХ-ийн гинжийг бие биенээ нөхдөг.

Цикл бүр нь денатурат, задрал, уртасгасан, ДНХ-ийн агууламжийг хоёр дахин нэмэгдүүлдэг.Одоогийн байдлаар олшруулалтын талбай богино тул Taq ферментийн идэвхжил оновчтой биш байсан ч зарим ПГУ-ыг маш богино хугацаанд хуулбарлах боломжтой тул үүнийг хоёр үе шат болгон өөрчлөх, өөрөөр хэлбэл 60 ° C-65 ° C-т нэгэн зэрэг нэвчилт, өргөтгөл хийх боломжтой.Өргөх, хөргөх үйл явцыг багасгах, хариу урвалын хурдыг сайжруулах зорилгоор.

ПГУ-ын урвалын онцлог

● Өндөр нарийвчлалтай

ПГУ-ын хариу урвалын тодорхой шийдвэрлэх хүчин зүйлүүд нь: ①Праймер ба загвар ДНХ-ийн өвөрмөц хослол.②Үндсэн хослолын зарчим.③ТакДНХ полимеразын синтезийн урвалын үнэнч байдал.④Зорилтот генийн өвөрмөц байдал, консерватив байдал.

Праймер болон загваруудын зөв хослол нь гол зүйл юм.Праймер ба загварыг холбох, праймерын гинжийг сунгах нь шүлтлэг суурьтай тохирох зарчим дээр суурилдаг.Полимеразын синтезийн урвалын үнэнч байдал ба Taq ДНХ полимеразын өндөр температурт тэсвэртэй байдал нь урвал дахь загвар ба праймерыг холбох (нийлмэл) -ийг илүү өндөр температурт гүйцэтгэх боломжтой.Хослолын өвөрмөц байдал ихээхэн нэмэгддэг.Клип нь өндөр түвшний зөв байдлыг хадгалж чадна.Өндөр консерватив, өндөр консерватив шинж чанартай зорилтот генетикийн бүс нутгийг сонгосноор түүний өвөрмөц байдал илүү өндөр байдаг.

● Өндөр мэдрэмжтэй

ПГУ-ын бүтээгдэхүүний үйлдвэрлэлийн хэмжээг индексээр нэмэгдүүлж, микроконтроллерийн түвшинг микрограмм (мкг = -6) хүртэл нэмэгдүүлэхийн тулд Picker-ийн эхлэлийн загварыг (PG=10-12) өргөтгөх боломжтой.Зорилтот эсийг 1 сая эсээс илрүүлж болно;вирусыг илрүүлэхэд ПГУ-ын мэдрэмж нь 3 RFU (хоосон цэгүүд үүссэн нэгж) хүрч болно;Бактерийн шинжлэх ухаанд илрүүлэх хамгийн бага түвшин нь 3 бактери юм.

● Энгийн бөгөөд хурдан

ПГУ-ын тусгал нь өндөр температурт Taq ДНХ полимеразыг ашигладаг бөгөөд энэ нь урвалын уусмалыг нэг дор нэмдэг, өөрөөр хэлбэл ДНХ-ийн олшруулах уусмал болон усан ванны саванд доройтох-аннеаль-өргөтгөх урвал үүсгэдэг.Ерөнхийдөө олшруулах урвал 2-4 цагийн дотор дуусдаг.Өргөтгөсөн бүтээгдэхүүнийг ерөнхийдөө цахилгаан илдээр шинжилдэг бөгөөд изотоп хэрэглэх шаардлагагүй, цацраг идэвхт бохирдолгүй, сурталчилгаа хийхэд хялбар байдаг.

● Сорьцын цэвэр байдал бага байна

Вирус, бактери, өсгөвөрлөх эсийг салгах шаардлагагүй.ДНХ-ийн түүхий бүтээгдэхүүн, РНХ-ийг өсгөгч болгон ашиглаж болно.Цус, биеийн шингэн, ханиалгах угаагч шингэн, үс, эс, амьд эд зэрэг эмнэлзүйн сорьцыг ашиглан ДНХ-ийн олшруулагчийн илрүүлэлтийг шууд ашиглаж болно.

ПГУнийтлэг асуудлууд

● Хуурамч сөрөг, өсгөсөн зурвас байхгүй

ПГУ-ын урвалын гол үе шатуудад: ① нуклейн хүчлийн загвар бэлтгэх, ② праймерын чанар, өвөрмөц байдал, ③ ферментийн чанар ④ ПГУ-ын мөчлөгийн нөхцөл орно.Шалтгааныг олохын тулд дээрх холбоосууд дээр дүн шинжилгээ хийж, судлах хэрэгтэй.

Загварууд: ① Загвар нь янз бүрийн уураг агуулсан, ② Загварт Taq ферментийн дарангуйлагч, ③ Загвар дахь уураг, ялангуяа хромосом дахь бүлгийн уураг арилдаггүй.⑤ Деминерийн нуклейн хүчлийн доройтол нь нарийн биш юм.Фермент ба праймерын чанар сайн байвал олшруулах зурвас байхгүй бөгөөд энэ нь сорьцыг хоол боловсруулахад хамгийн их магадлалтай байдаг.Загварын нуклейн хүчлийг гаргаж авах үйл явцад ямар нэг зүйл буруу байгаа тул үр дүнтэй, тогтвортой хоол боловсруулах уусмал бэлтгэхийн тулд түүний процедурыг дур мэдэн өөрчлөх ёсгүй.

Ферментийн идэвхгүй байдал: ферментийн идэвхжил алдагдсан эсвэл хангалтгүй байгаа эсэхийг шинжлэхийн тулд шинэ фермент эсвэл хуучин болон шинэ ферментийг хамтад нь ашиглан хуурамч сөрөг үр дагаварт хүргэдэг.Taq фермент эсвэл этидиум бромид заримдаа мартагддаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

Праймер: праймерын чанар, праймерын концентраци, хоёр праймерын концентраци нь тэгш хэмтэй эсэх.Энэ нь ПГУ-ын бүтэлгүйтлийн нийтлэг шалтгаан эсвэл нэмэгдэж буй зурвас нь тохиромжгүй, тархах хандлагатай байдаг.Зарим багцын дугаарын праймерын чанарт асуудал гардаг.Хоёр праймер нь өндөр концентрацитай, бага концентрацтай тул бага үр ашигтай тэгш хэмт бус олшруулалтыг үүсгэдэг.Эсрэг арга хэмжээ нь: ① Нэгжийг нэгтгэхийн тулд сайн праймер сонгох.② Праймерын концентраци нь OD утгаас хамаарахаас гадна агар сахарын гель электрофорез хийхийн тулд праймерын анхны шингэнд анхаарлаа хандуулдаг.Праймер туузны бүс байх ёстой бөгөөд хоёр праймерын тод байдал нь ерөнхийдөө нийцэж байх ёстой.Бүс, ПГУ энэ үед бүтэлгүйтэж магадгүй бөгөөд үүнийг праймер синтезийн нэгжээр шийдэх хэрэгтэй.Хэрэв праймер өндөр байвал гэрэл гэгээ бага байх бөгөөд шингэлэх үед түүний концентрацийг тэнцвэржүүлэх шаардлагатай.③ Хөргөгчний олон хэсэг хөлдөх эсвэл удаан хугацаагаар хөргөхөөс сэргийлж, праймерыг муудаж, доройтуулахаас сэргийлэхийн тулд праймерыг төлж, өндөр концентрацитай хадгална.④ Праймерын урт нь хангалтгүй, праймеруудын хооронд ди кластер үүссэн зэрэг үндэслэлгүй загвартай.

Mg2+концентраци: Mg2+ионы концентраци нь ПГУ-ын олшруулалтын үр ашигт ихээхэн нөлөөлдөг.Хэт их концентраци нь ПГУ-ын олшруулагчийн эсрэг хүйсийг бууруулдаг.Хэрэв концентраци хэт бага байвал ПГУ-ын олшруулалтын гаралт нь тэлэлтийн зурвасгүйгээр ПГУ-ын олшруулалтыг бүтэлгүйтнэ.

Урвалын эзлэхүүний өөрчлөлт: ПГУ-ын олшруулалтад ашигладаг хэмжээ нь 20ul, 30ul, 50ul эсвэл 100uL, ПГУ-ын олшруулалтад зориулсан их хэмжээний өргөдлийг шинжлэх ухааны судалгаа, эмнэлзүйн туршилтын янз бүрийн зорилгод нийцүүлэн тогтоодог.20ул гэх мэт жижиг хэмжээсийг хийсний дараа размерыг хийхдээ хүйн ​​нөхцөлийг хийх шаардлагатай, эс бөгөөс энэ нь бүтэлгүйтэх болно.

Физик шалтгаан: ПГУ-ын олшруулалтад хувиргах нь маш чухал.Хэрэв доройтлын температур бага, доройтлын хугацаа богино бол энэ нь хуурамч сөрөг үед тохиолдох магадлалтай;Хэт бага дулааны температур нь өвөрмөц бус өсгөлтийг үүсгэж, тодорхой өсгөлтийн үр ашгийг бууруулдаг.ПГУ-ын олшруулалтын үр ашгийг бууруулахын тулд праймер болон загваруудын хослолд ихээхэн нөлөөлдөг.Заримдаа энэ нь ПГУ-ын бүтэлгүйтлийн шалтгаануудын нэг болох өргөтгөл эсвэл усанд уусдаг агшаагч дахь хэлбэлзэл, анивалт, өргөтгөсөн температурыг илрүүлэхийн тулд стандарт термометрийг ашиглах шаардлагатай байдаг.

Зорилтот дарааллын хувилбарууд: Хэрэв зорилтот дараалал, мутаци эсвэл устгал тохиолдвол загвар ба загвар хосолсон эсвэл зорилтот дараалал байхгүйгээс праймер болон загвар нь нэмэлт дарааллаа алдаж, ПГУ-ын олшруулалт амжилтгүй болно.

● Худал эерэг

ПГУ-ын олшруулах зурвас нь зорилтот дарааллын зурвастай нийцэж байгаа бөгөөд заримдаа түүний зурвас нь илүү цэвэр, өндөр байдаг.

Праймерын загвар тохиромжгүй: сонгосон олшруулалтын дараалал болон зориулалтын бус олшруулалтын дараалал нь ижил төстэй байдаг тул ПГУ-ын олшруулалт хийх үед олшруулсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн нь зориулалтын бус дараалал болно.Зорилтот дараалал нь хэт богино эсвэл праймер хэт богино бөгөөд энэ нь худал эерэг гарах хандлагатай байдаг.Дахин дизайн хийх хэрэгтэй.

Зорилтот дараалал буюу олшруулалтын бүтээгдэхүүний хөндлөн бохирдол: Энэ бохирдлын хоёр шалтгаан бий: Нэгдүгээрт, геномын бүхэлд нь буюу том сегментийн хөндлөн бохирдол нь хуурамч эерэг үр дүнд хүргэдэг.Энэ төрлийн худал эерэгийг дараах аргуудаар шийдэж болно: Ашиглалтын явцад болгоомжтой, болгоомжтой байгаарай, зорилтот дарааллыг дээжийн буу руу амьсгалах эсвэл төвөөс зугтах хоолойноос үсрэхээс сэргийлнэ.Өндөр температурыг тэсвэрлэх чадваргүй фермент, бодисоос бусад бүх урвалж, тоног төхөөрөмжийг өндөр даралтаар ариутгана.Төвөөс зугтах хоолой, дээжийг нэг дор ашиглах ёстой.Шаардлагатай бол сорьц нэмэхийн өмнө урвалын хоолой болон урвалжийг хэт ягаан туяанд өртөж, одоо байгаа нуклейн хүчлийг устгана.Хоёрдугаарт, агаарын бохирдол дахь жижиг хэлтэрхийнүүд.Эдгээр жижиг хэсгүүд нь зорилтот дарааллаас богино боловч тодорхой ижил төстэй шинж чанартай байдаг.Үүнийг бие биентэйгээ холбож болно.Праймеруудыг нөхсөний дараа ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг өргөжүүлэх боломжтой бөгөөд энэ нь хуурамч эерэг үйлдвэрлэлийг бий болгоно.Энэ нь үүр ПГУ-ын аргыг багасгах эсвэл арилгахад ашиглаж болно.

● Өсгөлтийн өвөрмөц бус зурвас гарч ирнэ

ПГУ-ын олшруулалтын дараа гарч ирсэн зурвасууд нь хүлээгдэж буй хэмжээтэй, эсвэл том эсвэл жижиг, эсвэл нэгэн зэрэг, эсвэл тодорхой олшруулах зурвас ба өвөрмөц бус олшруулалтын зурвастай нийцэхгүй байна.Өвөрмөц бус зурвасууд үүсэх нь: Нэгдүгээрт, праймерууд нь зорилтот дараалалд бүрэн бус нэмэлт, эсвэл праймерын полимержилт нь ди кластер үүсгэдэг.Хоёр дахь нь MG2+ ионы концентраци хэт өндөр, зөөлрүүлэх температур хэт бага, ПГУ-ын циклийн тоо хамааралтай.Хоёрдугаарт, ферментийн чанар, хэмжээ.Ихэнхдээ зарим эх үүсвэрийн ферментүүд тусгай бус зурваст өртөмтгий байдаг ба бусад эх үүсвэрийн ферментүүд үүсдэггүй.Заримдаа ферментийн өвөрмөц бус олшруулалт бас тохиолддог.Үүний эсрэг арга хэмжээ нь: шаардлагатай бол сэтгэл татам зүйлсийг дахин зохион бүтээх.Ферментийн хэмжээг багасгах эсвэл өөр эх үүсвэрийн ферментийг солих.Анхан шатны хэмжээг багасгаж, загваруудын хэмжээг зохих ёсоор нэмэгдүүлж, мөчлөгийн тоог багасгах.Хатаах температурыг зөв нэмэгдүүлэх эсвэл температурын хоёр цэгийн аргыг ашиглана уу (93 ° C-ийн доройтол, 65 ° C-д үржих, сунгах).

● Ширхэг, түрхэцтэй тууз гарч ирнэ

ПГУ-ын олшруулалтыг заримдаа түрхсэн эсвэл бүрхүүлтэй эсвэл хивсэнцэртэй төстэй бүсээр хийдэг.Учир нь ферментийн хэмжээ хэт ихэссэн эсвэл ферментийн чанар муу зэргээс шалтгаалан dNTP-ийн концентраци хэт өндөр, Mg2+ концентраци хэт өндөр, зөөлрүүлэх температур хэт бага, циклийн тоо хэт их байна.Эсрэг арга хэмжээ нь: ①Ферментийн хэмжээг багасгах эсвэл өөр эх үүсвэрийн ферментийг өөрчлөх.②dNTP-ийн концентрацийг бууруулна ③Mg2+ концентрацийг зөв бууруулна.④Загваруудын тоог нэмэгдүүлж, мөчлөгийн тоог багасгана.

Холбоотой бүтээгдэхүүн

PCR Heroᵀᴹ (Будагтай)

◮ Өндөр үнэнч байдал: энгийн Taq ферментээс 6 дахин их;

◮ Илүү хурдан өсгөх хурд

◮ Загварт дасан зохицох чадвар

◮ Өндөр өсгөлтийн үр ашиг

◮ Хүрээлэн буй орчны хүлцэл нь илүү хүчтэй: 37 ° C-д долоо хоногийн турш байрлуулж, 90% -иас дээш идэвхжилийг хадгалах;

◮ 5'→3' ДНХ полимераза, 5'→3' экзонуклеазын идэвхжилтэй, 3'→5' экзонуклеазын идэвхжилгүй.

PCR Easyᵀᴹ (Будагтай)

Өвөрмөц урвалын систем ба өндөр үр ашигтай Так ДНХ Полимераз нь ПГУ-ын урвалыг олшруулах үр ашиг, өвөрмөц чанар, мэдрэмжтэй болгодог.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Нэг алхам)-SYBR Green I

◮ Нэг алхамт иж бүрдэл нь урвуу транскрипц болон qPCR хоёр урвалыг нэг хоолойд хийх бөгөөд зөвхөн загвар РНХ, тодорхой ПГУ-ын праймер болон RNase-Free ddH нэмэхэд л хангалттай.₂O.

◮ Энэхүү иж бүрдэл нь вирусын РНХ эсвэл РНХ-ийн ул мөрийг хурдан бөгөөд үр дүнтэй тоон байдлаар шинжлэх боломжтой.

◮ Энэхүү иж бүрдэл нь Foregene урвуу транскрипцийн өвөрмөц урвалж ба Foregene HotStar Taq ДНХ Полимеразыг хосгүй урвалын системтэй хослуулан олшруулах үр ашиг, урвалын өвөрмөц байдлыг үр дүнтэй сайжруулахад ашигладаг.

◮ Оновчтой урвалын систем нь урвалыг илүү мэдрэгчтэй, илүү хүчтэй дулааны тогтвортой байдал, илүү сайн тэсвэрлэх чадвартай болгодог.

◮ RT-qPCR хялбар^TM(Нэг алхам)-SYBR Green I иж бүрдэл нь ROX дотоод лавлагаа будагчтай хамт ирдэг бөгөөд энэ нь худгийн хоорондох дохионы дэвсгэр болон дохионы алдааг арилгахад хэрэглэгддэг бөгөөд энэ нь хэрэглэгчдэд тоон үзүүлэлтийн ПГУ-ын янз бүрийн загварт ашиглахад тохиромжтой.

RT хялбар^TMII (Мастер премикс Эхний хэлхээний cDNA синтезБодит цагийн ПГУ)

-2 минутын дотор загварт байгаа гДНХ-г арилгах үр дүнтэй чадвар.

-Үр ашигтай урвуу транскрипцийн систем, эхний хэлхээний cDNA-ийн нийлэгжилтийг дуусгахад ердөө 15 минут зарцуулдаг.

-Цогц загварууд: GC-ийн өндөр агуулгатай, нарийн төвөгтэй хоёрдогч бүтэцтэй загваруудыг мөн өндөр үр ашигтайгаар эргүүлж болно.

-Өндөр мэдрэмжтэй урвуу транскрипцийн систем, pg түвшний загварууд нь өндөр чанарын cDNA авах боломжтой.

-Урвуу транскрипцийн систем нь өндөр дулааны тогтвортой байдал, оновчтой урвалын температур нь 42 ℃ бөгөөд 50 ℃-т урвуу транскрипцийн сайн гүйцэтгэлтэй хэвээр байна.