ПГУ (полимеразын гинжин урвал) нь 30 гаруй жилийн түүхтэй, in vitro ДНХ олшруулах технологийн нэг юм.

ПГУ-ын технологийг 1983 онд АНУ-ын Сетусын Кари Муллис анхлан нэвтрүүлсэн. Муллис 1985 онд ПГУ-ын патент авах хүсэлт гаргаж, мөн онд Шинжлэх ухааны тухай ПГУ-ын анхны эрдэм шинжилгээний өгүүлэл нийтлүүлсэн.Муллис 1993 онд химийн чиглэлээр Нобелийн шагнал хүртсэн.

ПГУ-ын үндсэн зарчмууд

ПГУ нь зорилтот ДНХ-ийн хэсгүүдийг нэг сая гаруй удаа өсгөж чаддаг.Уг зарчим нь ДНХ полимеразын катализаторын дор байдаг бөгөөд эх хэлхээний ДНХ-ийг загвар болгон, тусгай праймерыг өргөтгөх эхлэлийн цэг болгон ашигладаг.Энэ нь денатураци, анялах, сунгах зэрэг үе шатуудаар in vitro-д хуулбарлагддаг.ДНХ-ийн эх хэлхээний загварт нэмэлт охин хэлхээний ДНХ-ийн үйл явц.

Стандарт ПГУ-ын процесс нь гурван үе шатанд хуваагдана.

1.Денатураци: ДНХ-ийн давхар хэлхээг салгахын тулд өндөр температурыг ашиглана.ДНХ-ийн давхар хэлхээ хоорондын устөрөгчийн холбоо нь өндөр температурт (93-98℃) тасалддаг.

2. Аннеалах: Давхар хэлхээтэй ДНХ-г салгасны дараа праймерыг нэг хэлхээтэй ДНХ-тэй холбохын тулд температурыг бууруулна.

3. Өргөтгөл: ДНХ полимераз нь температур буурах үед холбогдсон праймеруудаас ДНХ-ийн хэлхээний дагуу нэмэлт хэлхээг нэгтгэж эхэлдэг.Өргөтгөл дууссаны дараа мөчлөг дуусч, ДНХ-ийн хэсгүүдийн тоо хоёр дахин нэмэгддэг

Эдгээр гурван алхмыг 25-35 удаа давтах нь ДНХ-ийн хэлтэрхийний тоо огцом нэмэгдэх болно.

ПГУ-ын авъяас чадвар нь өөр өөр зорилтот генүүдэд зориулж өөр өөр праймеруудыг зохион бүтээх боломжтой бөгөөд ингэснээр зорилтот генийн хэсгүүдийг богино хугацаанд олшруулж болно.

Одоогийн байдлаар ПГУ-ыг энгийн ПГУ, флюресцент тоон ПГУ, дижитал ПГУ гэж гурван төрөлд хувааж болно.

Энгийн ПГУ-ын эхний үе

Зорилтот генийг олшруулахын тулд энгийн ПГУ-ын олшруулалтын хэрэгслийг ашиглан бүтээгдэхүүнийг илрүүлэхийн тулд агароз гель электрофорез ашиглан зөвхөн чанарын шинжилгээ хийх боломжтой.

Эхний үеийн ПГУ-ын гол сул талууд:

1.Өвөрмөц бус олшруулалт, хуурамч эерэг үр дүн гарах хандлагатай.

2.Илрүүлэхэд удаан хугацаа шаардагддаг бөгөөд үйл ажиллагаа нь төвөгтэй байдаг.

3.Зөвхөн чанарын шалгалт хийж болно

Хоёр дахь үеийн бодит цагийн ПГУ

qPCR гэгддэг бодит цагийн ПГУ нь урвалын системийн явцыг илтгэх флюресцент датчикийг ашигладаг бөгөөд флюресцент дохионы хуримтлалаар дамжуулан олшруулсан бүтээгдэхүүний хуримтлалыг хянаж, флюресцентийн муруйгаар үр дүнг шүүдэг.Үүнийг Cq утга ба стандарт муруйны тусламжтайгаар тоолж болно.

qPCR технологи нь хаалттай системд явагддаг тул бохирдох магадлал багасч, флюресценцийн дохиог хянаж тоон илрүүлэх боломжтой байдаг тул эмнэлзүйн практикт хамгийн өргөн хэрэглэгдэж, ПГУ-ын зонхилох технологи болоод байна.

Бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ-д ашигладаг флюресцент бодисуудыг TaqMan флюресцент датчик, молекулын гэрэлт цамхаг, флюресцент будаг гэж хувааж болно.

1) TaqMan флюресцент датчик:

ПГУ-ын олшруулалтын явцад хос праймер нэмэхийн зэрэгцээ тусгай флюресцент датчик нэмнэ.Уг датчик нь олигонуклеотид бөгөөд хоёр үзүүрийг сурвалжлагч флюресцент бүлэг болон унтраагч флюресцент бүлэг гэж тэмдэглэсэн байна.

Сорьц бүрэн бүтэн байх үед сурвалжлагчийн бүлгээс ялгарах флюресцент дохио нь бөхөөх бүлэгт шингэдэг;ПГУ-ын олшруулалтын явцад Taq ферментийн 5′-3′ экзонуклеазын идэвхжил нь датчикийг задалж, доройтуулж, сурвалжлагч флюресцент бүлэг ба унтрагч болгодог бөгөөд ингэснээр флюресцентийн хяналтын систем нь флюресценцийн дохиог хүлээн авах боломжтой, өөрөөр хэлбэл ДНХ-ийн хэлхээ олшрох бүрт томуу, томуу, томуу, томуу үүсэх, дохио нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүн үүсэхтэй бүрэн синхрончлогддог.

2) SYBR флюресцент будаг:

ПГУ-ын урвалын системд SYBR флюресцент будгийг илүүдэл хэмжээгээр нэмнэ.SYBR флюресцент будгийг ДНХ-ийн давхар хэлхээнд тусгайлан оруулсны дараа флюресцент дохиог ялгаруулдаг.Гинжинд ороогүй SYBR будгийн молекул нь флюресцент дохиог гаргахгүй бөгөөд ингэснээр флюресцент дохиог баталгаажуулна. ПГУ-ын бүтээгдэхүүний өсөлт нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний өсөлттэй бүрэн синхрончлогддог.SYBR нь зөвхөн хоёр хэлхээтэй ДНХ-тэй холбогддог тул хайлах муруйг ашиглан ПГУ-ын урвал өвөрмөц эсэхийг тодорхойлох боломжтой.

3) Молекулын гэрэлт цамхаг:

Энэ нь ишний гогцоотой давхар шошготой олигонуклеотид датчик бөгөөд 5 ба 3 төгсгөлд ойролцоогоор 8 суурьтай үсний хавчаар үүсгэдэг.Хоёр төгсгөлд байгаа нуклейн хүчлийн дараалал нь харилцан бие биенээ хосолсон байдаг бөгөөд энэ нь флюресцент бүлэг болон бөхөөх бүлгийг нягт болгодог.Хаах, флюресцент үүсэхгүй.

ПГУ-ын бүтээгдэхүүн үүссэний дараа, анивчих процессын явцад молекулын гэрлийн дунд хэсгийг тодорхой ДНХ-ийн дараалалтай хослуулж, флюресцент генийг унтраагч генээс салгаж, флюресцент үүсгэдэг.

Хоёр дахь үеийн ПГУ-ын гол сул талууд:

Мэдрэмж дутмаг хэвээр байгаа бөгөөд бага хуулбартай сорьцыг илрүүлэх нь буруу байна.

Суурь утгын нөлөөлөл байдаг бөгөөд үр дүн нь хөндлөнгийн нөлөөнд өртөмтгий байдаг.

Урвалын системд ПГУ-ын дарангуйлагчид байгаа үед илрүүлэх үр дүн нь хөндлөнгийн нөлөөнд өртөмтгий байдаг.

Гурав дахь үеийн дижитал ПГУ

Дижитал ПГУ (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) нь эцсийн цэг илрүүлэх замаар зорилтот дарааллын хуулбарын дугаарыг тооцоолж, дотоод хяналт, стандарт муруйг ашиглахгүйгээр үнэн зөв үнэмлэхүй тоон илрүүлэлтийг хийх боломжтой.

Дижитал ПГУ нь эцсийн цэгийн илрүүлэлтийг ашигладаг бөгөөд Ct-ийн утгаас (мөчлөгийн босго) хамаардаггүй тул дижитал ПГУ-ын урвал нь олшруулалтын үр ашгийн нөлөөнд бага өртөж, ПГУ-ын урвалын дарангуйлагчдын хүлцэл сайжирч, өндөр нарийвчлалтай, давтагдах боломжтой.

Өндөр мэдрэмжтэй, өндөр нарийвчлалтай тул ПГУ-ын урвал дарангуйлагчийн нөлөөнд амархан өртдөггүй бөгөөд стандарт бүтээгдэхүүнгүйгээр жинхэнэ үнэмлэхүй хэмжигдэхүүнийг гаргаж чаддаг нь судалгаа, хэрэглээний халуун цэг болсон.

Урвалын нэгжийн янз бүрийн хэлбэрийн дагуу үүнийг гурван үндсэн төрөлд хувааж болно: бичил шингэн, чип, дусал систем.

1) Микрофлюид дижитал ПГУ, mdPCR:

Микрофлюидик технологид үндэслэн ДНХ-ийн загварыг тусгаарладаг.Микрофлюидик технологи нь дээжийг нано-сайжруулах эсвэл жижиг дусал үүсгэх боломжтой боловч дуслыг шингээх тусгай арга, дараа нь ПГУ-ын урвалын системтэй хослуулах шаардлагатай.mdPCR-ийг орлуулах өөр аргуудаар аажмаар нэвтрүүлсэн.

2) Дусал дээр суурилсан дижитал ПГУ, ddPCR:

Дээжийг дусал болгон боловсруулж, нуклейн хүчлийн молекул агуулсан урвалын системийг тус бүр нь илрүүлэх нуклейн хүчлийн зорилтот молекулыг агуулаагүй, эсвэл нэгээс хэд хэдэн нуклейн хүчлийн зорилтот молекул агуулсан олон мянган нано хэмжээний дусал болгон хуваахдаа тосонд ус дусал үүсгэх технологийг ашиглана.

3) Чип дээр суурилсан дижитал ПГУ, cdPCR:

Шингэний замын нэгдсэн технологийг ашиглан цахиур хавтан эсвэл кварц шилэн дээр олон бичил хоолой, бичил хөндийг сийлж, өөр өөр хяналтын хавхлагаар дамжуулан уусмалын урсгалыг хянаж, дээжийн шингэнийг ижил хэмжээтэй нанометрт хуваагаад дижитал ПГУ-ын урвалын урвалын цооногуудад үнэмлэхүй хэмжигдэхүүнийг гаргана.

Гурав дахь үеийн ПГУ-ын гол сул талууд:

Тоног төхөөрөмж, урвалжууд нь үнэтэй байдаг.

Загварын чанарын шаардлага өндөр байна.Хэрэв загварын тоо хэмжээ нь микросистемийн хэмжигдэхүүнээс хэтэрсэн бол тоон үзүүлэлтийг тодорхойлох боломжгүй, хэтэрхий бага байвал тоон үзүүлэлтийн нарийвчлал буурна.

Өвөрмөц бус олшруулалттай үед хуурамч эерэг үр дүн гарч болно.