COVID-19 нь амьсгалын замын цочмог хам шинжийн 2-р хэлбэрээс үүдэлтэй халдварт өвчин юм. Хүн халдвар авсан үед халуурах, ханиалгах, амьсгал давчдах зэрэг шинж тэмдгүүд илэрдэг.

Шинжилгээнд ашигласан дээжийг хамар залгиурын арчдас эсвэл ам залгиурын арчдасаар цуглуулж болно.

ПГУ гэж юу вэ?

Коронавирусыг илрүүлэх стандарт арга бол полимеразын гинжин урвал, ПГУ юм.Энэ бол молекул биологид өргөн хэрэглэгддэг арга юм.Энэ нь хэдэн саяас хэдэн тэрбумаар тодорхой ДНХ-ийн хэсгүүдийг хурдан хуулж чаддаг.

Шинэ коронавирус нь маш урт нэг судалтай РНХ геном агуулдаг.Эдгээр вирусыг ПГУ-аар илрүүлэхийн тулд РНХ-ийн молекулуудыг урвуу транскриптазын тусламжтайгаар нэмэлт ДНХ-ийн дараалал болгон хувиргах ёстой бөгөөд дараа нь шинээр нийлэгжсэн ДНХ-ийг RT-PCR гэж нэрлэдэг стандарт ПГУ-ын аргаар олшруулж болно.

RT-ПГУ-ын процесс

РНХ олборлолт

Энэ аргыг хэрэгжүүлэхийн тулд вирусын РНХ-г үндсэндээ гаргаж авах хэрэгтэй.Тохиромжтой, хурдан бөгөөд үр дүнтэй салгахад РНХ цэвэршүүлэх олон төрлийн иж бүрдлийг ашиглаж болно.

Арилжааны иж бүрдэл ашиглан вирусын РНХ-г гаргаж авахын тулд эхлээд дээжийг микроцентрифугийн хоолойд нэмж, дараа нь лизисын буфертэй холино.Энэ буфер нь маш их денатуратлагдсан бөгөөд ихэвчлэн фенол, гуанидин изотиоцианатаас бүрддэг.Нэмж дурдахад RNase дарангуйлагчид вирусын РНХ-ийг бүрэн тусгаарлахын тулд лизисын буферт ихэвчлэн байдаг.

Лизийн буфер нэмсний дараа холигч хоолойг импульсээр эргүүлж, тасалгааны температурт өсгөвөрлөнө.Дараа нь вирус нь лизисын буферээр хангагдсан өндөр денатурацитай нөхцөлд задалдаг.

Дээжийг задалсаны дараа центрифугийн хоолойг цэвэршүүлэх процедурт ашигладаг.Дээжийг центрифугийн хоолойд хийж, дараа нь центрифуг хийнэ.

Энэ процедур нь суурин фаз нь цахиурын гель матрицаас бүрдэх хатуу фазын олборлох арга юм.

Давс ба рН-ийн оновчтой нөхцөлд РНХ молекулууд цахиурын мембрантай холбогддог.

Үүний зэрэгцээ уураг болон бусад бохирдуулагчийг зайлуулдаг.

Центрифуг хийсний дараа центрифугийн хоолойг цэвэр цуглуулах хоолойд хийж, шүүсэн бодисыг хаяж, дараа нь угаах буфер нэмнэ.

Угаах буферийг мембранаар нэвтрүүлэхийн тулд хоолойг дахин центрифугт хийнэ.Энэ нь мембранаас үлдсэн бүх хольцыг зайлуулж, зөвхөн РНХ нь цахиурт гельтэй холбогдоно.

Дээжийг угаасны дараа хоолойг цэвэр микроцентрифугийн хоолойд хийж, ялгаруулах буфер нэмнэ.

Дараа нь ялгаруулах буферийг мембранаар шахахын тулд центрифуг хийнэ.Элюцийн буфер нь ээрэх баганаас вирусын РНХ-ийг зайлуулж, уураг, дарангуйлагч болон бусад бохирдуулагч бодисоос ангид цэвэршүүлсэн РНХ-ийг олж авдаг.

АЛХАМ 2

Холимог баяжмал

Вирусын РНХ-г гарган авсны дараа дараагийн алхам нь ПГУ-ын олшруулалтад урвалын хольц бэлтгэх явдал юм.Энэ үе шатанд баяжмалыг ашигладаг.Энэхүү төвлөрсөн уусмал нь урьдчилсан хольц, урвуу транскриптаза, нуклеотид, урагшлах праймер, урвуу праймер, TaqMan датчик, ДНХ полимераза зэргээс бүрдсэн урьдчилан хольсон төвлөрсөн уусмал юм.

Эцэст нь энэ урвалын хольцыг дуусгахын тулд РНХ-ийн загварыг нэмнэ.Хоолойг импульсийн эргэлтээр хольж, дараа нь урвалын хольцыг ПГУ-ын хавтан руу ачаална.ПГУ-ын хавтан нь ихэвчлэн 96 цооног агуулдаг бөгөөд олон дээжийг нэгэн зэрэг шинжлэх боломжтой.

АЛХАМ 3

ПГУ-ын олшруулалт

Дараа нь хавтанг ПГУ-ын машинд байрлуулна, энэ нь үндсэндээ дулааны эргэлтийн төхөөрөмж юм.

Бодит цагийн RT-PCR нь RdrRP ген, E ген, N генийн зорилтот дарааллыг нэмэгдүүлэх замаар 2019 оны шинэ коронавирусыг илрүүлэхэд ашиглагддаг.Зорилтот генийн сонголт нь праймер болон датчикийн дарааллаас хамаарна.

RT-ПГУ-ын эхний алхам бол урвуу транскрипци юм.Нэмэлт ДНХ-ийн эхний хэлхээ нь нийлэгждэг бөгөөд энэ нь ПГУ-ын урвуу праймераар үүсгэгддэг бөгөөд энэ нь вирусын РНХ геномын нэмэлт хэсэгтэй холбогддог.Дараа нь урвуу транскриптаза нь вирусын РНХ-д нэмэлт ДНХ-ийг нэгтгэхийн тулд праймерын 3′ төгсгөлд ДНХ нуклеотидуудыг нэмдэг.Энэ алхамын температур ба үргэлжлэх хугацаа нь ашигласан праймер, зорилтот РНХ, урвуу транскриптаза зэргээс хамаарна.

Дараа нь денатурацийн эхний алхамыг хийх бөгөөд энэ нь РНХ-ДНХ-ийн эрлийз денатурацид хүргэдэг.Энэ алхам нь ДНХ полимеразыг идэвхжүүлэхэд зайлшгүй шаардлагатай.Үүний зэрэгцээ урвуу транскриптаза идэвхгүй болно.

ПГУ нь хэд хэдэн дулааны циклээс бүрдэнэ.Цикл бүр нь денатураци, анялах, сунгах үе шатуудаас бүрдэнэ.

Денатурацийн үе шат нь урвалын камерыг 95 хэм хүртэл халааж, давхар судалтай ДНХ-ийн загварыг денатурацид ашиглах явдал юм.

Дараагийн алхамд урвалын температурыг Цельсийн 58 хэм хүртэл бууруулж, урагшлах праймер нь нэг судалтай ДНХ загварынхаа нэмэлт хэсэг рүү залгах боломжийг олгоно.Хатаах температур нь праймерын урт, найрлагаас шууд хамаарна.

Өргөтгөх шатанд ДНХ полимераз нь ДНХ-ийн загвар хэлхээнд нэмэлт болох шинэ ДНХ хэлхээг нэгтгэдэг.Урвалын хольцоос 5′-ээс 3′ чиглэлд загварт нэмэлт чөлөөт цөмүүдийг нэмснээр.Энэ үе шатны температур нь ашигласан ДНХ полимеразаас хамаарна.

Эхний мөчлөгийн дараа хоёр хэлхээтэй ДНХ-ийн зорилтыг олж авдаг.

Дараа нь хоёр дахь мөчлөгийг оруулна уу.Давхар хэлхээтэй ДНХ нь денатурат болж хоёр нэг хэлхээтэй ДНХ молекулыг үүсгэдэг.

Дараагийн алхамд урвалын температурыг бууруулж, праймеруудыг нэг судалтай ДНХ-ийн загвар болгон, Taq-man датчикийг зорилтот ДНХ-ийн нэмэлт хэсэгт бэхлэнэ.

TaqMan датчик нь олигонуклеотидын датчикийн 5′ төгсгөлтэй ковалент байдлаар холбогдсон флюрофороос бүрдэнэ.Цикллерийн гэрлийн эх үүсвэрээр өдөөгдсөн үед флюрофор нь флюресцент ялгаруулдаг.Нэмж дурдахад датчик нь 3′ төгсгөлд унтраагчаас бүрдэнэ.Сурвалжлагч ген нь унтраагчтай ойрхон байгаа нь флюресценцийг илрүүлэхээс сэргийлдэг.

Өргөтгөх шатанд ДНХ полимераз нь шинэ хэлхээг нэгтгэдэг.Полимераз нь TaqMan датчик руу хүрэхэд түүний эндоген 5′нуклеазын идэвхжил нь датчикийг тасалж, будгийг бөхөөгчөөс тусгаарладаг.

ПГУ-ын мөчлөг бүрт илүү олон будгийн молекулууд ялгарч, улмаар нийлэгжсэн ампликоны тоотой пропорциональ флюресценцийн эрчим нэмэгддэг.

Энэ арга нь дээжинд байгаа өгөгдсөн дарааллын тоог тооцоолох боломжийг олгодог.Давхар хэлхээтэй ДНХ-ийн хэсгүүдийн тоо мөчлөг бүрт хоёр дахин нэмэгддэг.Тиймээс ПГУ-ын тусламжтайгаар маш жижиг дээжийг шинжлэх боломжтой.

Флюресцент дохиог хэмжихийн тулд вольфрамын галоген чийдэн, өдөөх шүүлтүүр, тусгал, линз, ялгаруулалтын шүүлтүүр, цэнэглэх хосолсон төхөөрөмжтэй CCD камер ашигладаг.

АЛХАМ 4 Илрүүлэх

Флюресцент дохиог хэмжихийн тулд вольфрамын галоген чийдэн, өдөөх шүүлтүүр, тусгал, линз, ялгаруулалтын шүүлтүүр, цэнэглэх хосолсон төхөөрөмжтэй CCD камер ашигладаг.

Дэнлүүнээс шүүгдсэн гэрэл нь тусгалаар тусч, конденсаторын линзээр дамжин өнгөрч, нүх бүрийн төвд төвлөрдөг.Дараа нь нүхнээс ялгарах флюресцент нь толинд тусч, ялгаруулалтын шүүлтүүрээр дамжин өнгөрч, CCD камераар илрүүлдэг.ПГУ-ын мөчлөг бүрт өөрөө өдөөгдсөн флюрофорын гэрлийг CCD-ээр илрүүлж болно.

Энэ нь авсан гэрлийг дижитал өгөгдөл болгон хувиргадаг.Энэ аргыг бодит цагийн ПГУ гэж нэрлэдэг бөгөөд энэ нь ПГУ-ын урвалын явцыг бодит цаг хугацаанд хянах боломжийг олгодог.