Хүн бүр qRT-PCR туршилтын зарчим, праймер дизайн, үр дүнгийн тайлбар гэх мэтийн талаар ярьж байгаа ч би та бүхэнтэй qRT-PCR-ийн туршилтын ажиллагааг хуваалцах ёстой гэж бодож байна.Энэ нь жижиг боловч үр дүнгийн тухай юм.
qRT-PCR хийхээсээ өмнө бид өөрсдийн РНХ болон үйл ажиллагааны аргын талаар тодорхой ойлголттой байх хэрэгтэй.Эцсийн эцэст бидний хүчин чармайлт зүгээр л дасгал хийхээс илүү үр дүнд хүрэхэд чиглэгддэг.Тиймээс qRT-PCR хийхээсээ өмнө бид дараах асуудлуудыг тодорхойлох хэрэгтэй (зарим нь зөвхөн SYBR-д хамаарна).
1 Таны РНХ муудаагүй гэдэгт итгэлтэй байна уу?
NanoDrop 2000 нь зөвхөн РНХ-ийн концентраци болон цэвэр байдлыг илрүүлэх боломжтой боловч РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг илрүүлж чадахгүй.
RNA (RNA Intesity Number) утга нь Agilent 2100 Bioanalyzer системээр илрүүлсэн РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг илэрхийлж болно.
Зураг. Өөр өөр РНХ дээжийн (эукариот) RIN утгын бүдүүвч диаграмм.
Гэсэн хэдий ч лабораториудад ерөнхийдөө Agilent 2100 Bioanalyzer байдаггүй.Энэ тохиолдолд бид формальдегидийн гельээр дамжуулан илрүүлж болох боловч РНХ-ийн нийт хэмжээний шаардлага өндөр байдаг тул энгийн гель электрофорез ашиглах нь хамгийн хурдан арга юм.Энэ нь нуклеазгүй орчинд байх шаардлагатай тул электрофорезийн сав, уусмалын сав, гель хаалт, самнуудыг DEPC усаар зайлах шаардлагатай.Агароз нь мөн нуклеазгүй (шинээр нээгдсэн л бол) бөгөөд Ачаалах буферийг аль болох 1.2% гельтэй шинээр нээх хэрэгтэй.
Гель нь бүрэн ууссан байх ёстойг анхаарна уу, эс тэгвээс энэ нь зураг дээрх 9-р дээж дээр үзүүлсэн шиг жигд бус тууз үүсгэх болно.Хэрэв хүчдэл хэт өндөр эсвэл хэт удаан ажиллаж байвал дулааныг үүсгэж, РНХ-ийн доройтолд хүргэдэг тул хүчдэл, цагийг зохистой хянах хэрэгтэй.Нэмж дурдахад, гель ажиллуулах нь дээжинд ДНХ-ийн үлдэгдэл байгаа эсэхийг цаашид тодорхойлж, түгээх худагт олон тооны хадгалагдсан тууз байгаа эсэхийг ажиглах боломжтой.
Зураг.РНХ-ийн гель электрофорез илрүүлэх
2 Та өөрийн cDNA-ийн концентрацид итгэлтэй байна уу?
Лабораторийн том ах нарын туршлагаас харахад урвуу тус бүрээр гаргаж авсан 20 ul системийн cDNA-г шууд 20X шингэлдэг бол докторын дараах эгч нар 10X шингэлдэг.Би ихэвчлэн нөхцөл байдлаас хамаардаг.Хүн бүрийн дурьдсан РНХ-ийн чанар өөр өөр байдаг тул урвуу өөрчлөлтийн түвшин нь ч өөр, урвуу технологи нь тогтвортой биш байж болно.
Тиймээс би урвуу cDNA авах болгондоо эхлээд үүнийг 3 орчим удаа шингэлж, дараа нь цэвэршүүлэх генийг ашиглан RT-PCR хийх, мөчлөгийн тоо нь ерөнхийдөө 25 цикл бөгөөд тодорхой концентрацийг тодорхойлж, дараа нь эцсийн шингэрүүлэлтийн хүчин зүйлийг тодорхойлно.
3 Та праймераа хэрэглэхэд хялбар гэдэгт итгэлтэй байна уу?
Энэ нь qRT-PCR-ийн хайлах муруйг давж чаддаг ч энэ нь мөнгө шаарддаг.Их мөнгөгүй лабораториудад их хэмжээний праймер авахдаа энгийн RT-PCR ашиглан нэг тууз байгаа эсэхийг шалгаж, праймерын онцлогийг тодорхойлох боломжтой.Хэрэв лабораторид мөнгө дутахгүй бол бүх праймерын өвөрмөц чанарыг хайлах муруйгаар нэг удаа тодорхойлж болно.
4 Туршилтын нөхцөл тань тохиромжтой гэдэгт итгэлтэй байна уу?
SYBR нь хүчтэй гэрлээс хамгаалагдсан байх ёстой тул SYBR урвалж нэмэхдээ дээд талын гэрлийг унтрааж, дуусгахын тулд зөвхөн бүдэг гэрэл ашиглах хэрэгтэй.
SYBR-ийг 4°С хэмд хадгална.Ашиглаж байх үед хөөс гаргахгүйн тулд сайтар холихын тулд дээш доош зөөлөн эргүүлж, хүчтэй эргүүлж болохгүй.
Зарим дүү нар дээжийг холихоос эмээж ПГУ-ын самбар дээр тэмдэг зурах дуртай байдаг нь буруу юм.Таны маркерууд флюресцент дохионы цуглуулгад нөлөөлөх магадлал өндөр байдаг тул би өсвөр насныханд доор үзүүлсэн шиг санах ойд туслах туршилтын дэвтэр ашиглахыг зөвлөж байна.
Зураг.qRT-ПГУ-ын дээж ачаалах диаграмм
5 Та үүнийг зөв хийж байгаа гэдэгтээ итгэлтэй байна уу?
Бээлий өмсөж, бээлий өмсөж, бээлий өмсөж, чухал зүйлийг гурван удаа хэлэхээ мартуузай.
SYBR-ийн гэрлийн нөлөөг багасгахын тулд би хувьдаа эхлээд доорх зурагт үзүүлсэн шиг загвар нэмэх дуртай.Туршлагаас харахад бага хэмжээний загвар нэмэх нь түүврийн алдаа гаргах магадлалтай.Тиймээс, бага хэмжээний загвар нэмсэнээс үүсэх алдааг багасгахын тулд би ихэвчлэн дээжийг дахин хоёр дахин нэмэгдүүлж, нэмсэн H2O2-ийн хэмжээг багасгахын тулд дээж нэмэхдээ хэмжээг хоёр дахин нэмэгдүүлнэ.
Зураг.qRT-ПГУ-ын ачааллын бүдүүвч диаграм
Дараа нь qRT-PCR системийг дараах байдлаар тохируулна уу.
Зураг.qRT-ПГУ-ын системийн бэлтгэлийн диаграм
ТАЙЛБАР: Тохиргоог мөсөн дээр хийх шаардлагатай.
Дээжийг нэмсний дараа ил тод битүүмжлэх хальсыг наана.Тунгалаг битүүмжлэх хальсны гадаргуу дээр гараараа хүрэхгүй байхыг хичээгээрэй, зүгээр л хальсны хоёр талын зайнаас ажиллуулаарай.Учир нь хурууны хээ нь флюресцент дохиог цуглуулахад бас нөлөөлж болно.Дараа нь центрифуг ашиглан дээжийг хананд өлгөхгүйн тулд бага хурдтайгаар 10 секундын турш центрифуг хийнэ.
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
Шуудангийн цаг: 2023 оны 4-р сарын 28
