Лабораторид шинээр орж ирсэний хувьд хувиргалт багатай олон тооны ургамлаас эерэг ургамлуудыг ялгах нь тийм ч сайн ажил биш юм.Нэгдүгээрт, олон тооны дээжээс ДНХ-г нэг нэгээр нь гаргаж авах ёстой бөгөөд дараа нь гадны генийг ПГУ-аар илрүүлнэ.Гэсэн хэдий ч үр дүн нь ихэвчлэн хоосон, хааяа хэд хэдэн зүйлтэй тууз байдаг боловч алдсан илрүүлэлт эсвэл худал илрүүлэлт байгаа эсэхийг тодорхойлох боломжгүй юм..Ийм туршилтын үйл явц, үр дүнтэй нүүр тулна гэдэг үнэхээр арчаагүй хэрэг үү?Санаа зоволтгүй, ах танд трансген эерэг ургамлыг хэрхэн хялбар, үнэн зөв ялгахыг зааж байна.

1-р алхам

Дизайн илрүүлэх праймер

Шинжилгээнд хамрагдах дээжийн дагуу илрүүлэх эндоген ген ба экзоген генийг тодорхойлж, праймерын загварт зориулж генийн төлөөлөл 100-500bp дарааллыг сонгоно.Сайн праймер нь илрүүлэлтийн үр дүнгийн нарийвчлалыг баталгаажуулж, илрүүлэх хугацааг богиносгодог (түгээмэл хэрэглэгддэг илрүүлэх праймерыг хавсралтаас үзнэ үү).

Анхааруулга: Шинээр зохион бүтээсэн праймерууд нь том хэмжээний илрүүлэхийн өмнө урвалын нөхцлийг оновчтой болгож, илрүүлэлтийн нарийвчлал, нарийвчлал, илрүүлэх хязгаарыг шалгах шаардлагатай.

Алхам 2

Туршилтын протоколыг зохион бүтээх

Эерэг хяналт: ПГУ-ын урвалын систем болон нөхцөл хэвийн байгаа эсэхийг тодорхойлохын тулд зорилтот фрагментийг агуулсан цэвэршүүлсэн ДНХ-г загвар болгон ашиглана.

Сөрөг/хоосон хяналт: ПГУ-ын системд бохирдлын эх үүсвэр байгаа эсэхийг илрүүлэхийн тулд зорилтот фрагмент агуулаагүй ДНХ-ийн загвар эсвэл ddH2O-г загвар болгон ашиглана.

Дотоод лавлагааны хяналт: Загварыг ПГУ-аар илрүүлэх боломжтой эсэхийг үнэлэхийн тулд турших дээжийн эндоген генийн праймер/зондны хослолыг ашиглана.

Анхааруулга:

Туршилтын үр дүнгийн бодит байдлыг үнэлэхийн тулд тест бүрт эерэг, сөрөг/хоосон хяналт, дотоод хяналтын хяналтыг тогтооно.

Туршилтын бэлтгэл

Хэрэглэхийн өмнө уусмал жигд холилдсон эсэхийг ажигла.Хэрэв тунадас илэрвэл хэрэглэхийн өмнө зааврын дагуу уусгаж, холих шаардлагатай.2×ПГУ-ын хольцыг пипеткээр соруулж, ионы жигд бус тархалтаас зайлсхийхийн тулд хэрэглэхийн өмнө микропипеткээр дахин дахин холих шаардлагатай.

Анхааруулга:

Гарын авлагыг гаргаж аваад анхааралтай уншиж, зааварт заасан шаардлагын дагуу туршилт хийхээс өмнө бэлтгэлээ хангана.

Алхам 4

ПГУ-ын урвалын системийг бэлтгэх

Туршилтын протоколын дагуу праймер, H2O, 2×ПГУ-ыг жигд хольж, центрифуг хийж, урвалын хоолой бүрт тараана.

Анхааруулга:

Томоохон эсвэл урт хугацааны туршилтын хувьд UNG фермент агуулсан ПГУ-ын урвалын системийг ашиглахыг зөвлөж байна, энэ нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнээс үүдэлтэй аэрозолийн бохирдлоос үр дүнтэй зайлсхийх боломжтой.

Алхам 5

Урвалын загвар нэмнэ үү

Шууд ПГУ-ын технологийг ашигласнаар уйтгартай нуклейн хүчлийг цэвэршүүлэх процесс шаардлагагүй, дээжийн загварыг 10 минутын дотор бэлтгэж, харгалзах ПГУ-ын урвалын системийг нэмж болно.

Анхааруулга:

Хагалах арга нь илүү сайн илрүүлэх нөлөөтэй бөгөөд олж авсан бүтээгдэхүүнийг олон төрлийн илрүүлэх урвалд ашиглаж болно.

5.1: Навчны шууд тэлэлт

Гарын авлагын зургийн хэмжээгээр 2-3мм диаметртэй навчны эдийг огтолж, ПГУ-ын урвалын системд хийнэ.

Анхаарна уу: Навчны хэсгүүдийг ПГУ-ын урвалын уусмалд бүрэн дүрж, навчны эдийг хэт их хэмжээгээр нэмж болохгүй.

5.2: Навч хуваах арга

5-7мм диаметртэй навчны эдийг хайчилж, центрифугийн хоолойд хийнэ.Хэрэв та боловсорч гүйцсэн навчийг сонговол навчны гол судлын эдийг ашиглахаас зайлсхий.Пипеткээр 50ul Buffer P1 лизатыг центрифугийн хоолойд хийж, навчны эдийг бүрэн дүрж, дулааны циклатор эсвэл металл ваннд хийж, 95°С-т 5-10 минутын турш задлана.

50ul Buffer P2 саармагжуулах уусмал нэмээд сайтар холино.Үүссэн лизатыг загвар болгон ашиглаж, ПГУ-ын урвалын системд нэмж болно.

Тайлбар: Загварын хэмжээ нь ПГУ-ын системийн 5-10%-ийн хооронд байх ба 20%-иас хэтрэхгүй байх ёстой (жишээ нь, 20μl ПГУ-ын системд 1-2μl лизис уусмал нэмнэ, 4μl-ээс ихгүй).

Алхам 6

ПГУ-ын урвал

ПГУ-ын урвалын хоолойг центрифуг хийсний дараа олшруулах зорилгоор ПГУ-ын хэрэгсэлд хийнэ.

Анхааруулга:

Урвал нь олшруулахдаа цэвэршүүлээгүй загварыг ашигладаг тул олшруулах циклийн тоо нь цэвэршүүлсэн ДНХ загварыг ашиглахтай харьцуулахад 5-10 циклээр илүү байдаг.

Алхам 7

Электрофорез илрүүлэх, үр дүнд дүн шинжилгээ хийх

M: 100bp ДНХ шат

1\4: Цэвэршүүлсэн ДНХ-ийн арга

2\5: Шууд ПГУ-ын арга

3\6: Хоосон удирдлага

QC:

Туршилтанд тохируулсан янз бүрийн хяналтын туршилтын үр дүн нь дараах нөхцлийг хангасан байх ёстой.Үгүй бол асуудлын шалтгааныг шинжилж, асуудлыг арилгасны дараа дахин шинжилгээг хийх шаардлагатай.

Хүснэгт 1. Төрөл бүрийн хяналтын бүлгийн туршилтын хэвийн үр дүн

* Плазмидыг эерэг хяналт болгон ашиглах үед эндоген генийн шинжилгээний үр дүн сөрөг байж болно

Үр дүнгийн дүгнэлт:

A. Дээжний эндоген генийн шинжилгээний хариу сөрөг гарсан нь дээжээс энгийн ПГУ илрүүлэхэд тохиромжтой ДНХ-г гаргаж авах боломжгүй буюу гаргаж авсан ДНХ нь ПГУ-ын урвалын дарангуйлагч агуулсан тул ДНХ-ийг дахин гаргаж авах шаардлагатайг харуулж байна.

B. Дээжний эндоген генийн шинжилгээний хариу эерэг, экзоген генийн шинжилгээний хариу сөрөг гарсан нь дээжээс энгийн ПГУ-ыг илрүүлэхэд тохиромжтой ДНХ гаргаж авсан болохыг харуулж байгаа бөгөөд дээжээс ХХХ ген илрээгүй гэж дүгнэж болно.

C. Дээжний эндоген генийн шинжилгээний хариу эерэг, экзоген генийн шинжилгээний хариу эерэг гарсан нь дээжээс энгийн ПГУ-ыг илрүүлэхэд тохиромжтой ДНХ гаргаж авсан бөгөөд дээжийн ДНХ нь ХХХ генийг агуулж байна.Баталгаажуулах туршилтыг цаашид хийж болно.

Алхам 8

Дизайн илрүүлэх праймер

Туршилтын дараа 2% натрийн гипохлоритын уусмал, 70% этанолын уусмалаар туршилтын талбайг арчиж, орчны бохирдлоос сэргийлнэ.