Тойм
Трансген ургамлыг хурдан тодорхойлох
Текст/Тонг Ючэн
Туршилтын ажиллагаа/Хан Ин
Редактор/Вэн Южүн
Үг / 1600+
Санал болгож буй унших хугацаа/8-10 минут
Трансген ургамлыг хурдан тодорхойлох
Лабораторид шинээр орж ирж байгаа хүний хувьд хөрвөх чадвар багатай олон тооны ургамлаас эерэг ургамлуудыг ялгах нь тийм ч сайн ажил биш юм.Нэгдүгээрт, олон тооны дээжээс ДНХ-г нэг нэгээр нь гаргаж авах ёстой бөгөөд дараа нь гадны генийг ПГУ-аар илрүүлнэ.Гэсэн хэдий ч үр дүн нь ихэвчлэн хоосон, хааяа хэд хэдэн зүйлтэй тууз байдаг боловч алдсан илрүүлэлт эсвэл худал илрүүлэлт байгаа эсэхийг тодорхойлох боломжгүй юм..Ийм туршилтын үйл явц, үр дүнтэй нүүр тулна гэдэг үнэхээр арчаагүй хэрэг үү?Санаа зоволтгүй, ах танд трансген эерэг ургамлыг хэрхэн хялбар, үнэн зөв ялгахыг зааж байна.
1-р алхам: Дизайн илрүүлэх праймер
Шинжилгээнд хамрагдах дээжийн дагуу илрүүлэх эндоген ген ба экзоген генийг тодорхойлж, праймерын загварт зориулж генийн төлөөлөл 100-500bp дарааллыг сонгоно.Сайн праймер нь илрүүлэлтийн үр дүнгийн нарийвчлалыг баталгаажуулж, илрүүлэх хугацааг богиносгодог (түгээмэл хэрэглэгддэг илрүүлэх праймерыг хавсралтаас үзнэ үү).
Жич:
Шинээр зохион бүтээсэн праймерууд нь том хэмжээний илрүүлэлт хийхээс өмнө урвалын нөхцлийг оновчтой болгож, илрүүлэлтийн нарийвчлал, нарийвчлал, илрүүлэх хязгаарыг шалгах шаардлагатай.
Алхам 2:Туршилтын протокол боловсруулах
Эерэг хяналт: ПГУ-ын урвалын систем болон нөхцөл хэвийн байгаа эсэхийг тодорхойлохын тулд зорилтот фрагментийг агуулсан цэвэршүүлсэн ДНХ-г загвар болгон ашиглана.
Сөрөг/хоосон хяналт: ДНХ загвар эсвэл ddH ашиглана уу2ПГУ-ын системд бохирдлын эх үүсвэр байгаа эсэхийг илрүүлэх загвар болгон зорилтот фрагмент агуулаагүй O.
Дотоод лавлагааны хяналт: Загварыг ПГУ-аар илрүүлэх боломжтой эсэхийг үнэлэхийн тулд турших дээжийн эндоген генийн праймер/зондны хослолыг ашиглана.
Жич:
Туршилтын үр дүнгийн бодит байдлыг үнэлэхийн тулд тест бүрт эерэг, сөрөг/хоосон хяналт, дотоод хяналтын хяналтыг тогтооно.
Алхам 3: Туршилтын бэлтгэл
Хэрэглэхийн өмнө уусмал жигд холилдсон эсэхийг ажигла.Хэрэв тунадас илэрвэл хэрэглэхийн өмнө зааврын дагуу уусгаж, холих шаардлагатай.2×ПГУ-ын хольцыг пипеткээр соруулж, ионы жигд бус тархалтаас зайлсхийхийн тулд хэрэглэхийн өмнө микропипеткээр дахин дахин холих шаардлагатай.
Жич:
Зааврыг гаргаж аваад анхааралтай уншиж, зааврын дагуу туршилт хийхээс өмнө бэлтгэлээ хийнэ.
Алхам 4: ПГУ-ын урвалын системийг бэлтгэ
Туршилтын протоколын дагуу праймеруудыг холино, H2O, 2 × ПГУ-ыг хольж, центрифуг хийж, урвалын хоолой бүрт тараана.
Жич:
Томоохон эсвэл урт хугацааны туршилтын хувьд UNG фермент агуулсан ПГУ-ын урвалын системийг ашиглахыг зөвлөж байна, энэ нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнээс үүдэлтэй аэрозолийн бохирдлоос үр дүнтэй зайлсхийх боломжтой.
Алхам 5: Урвалын загвар нэмнэ үү
Шууд ПГУ-ын технологийг ашигласнаар нуклейн хүчлийг цэвэрлэх уйтгартай процесс шаардлагагүй болно.Дээжийн загварыг 10 минутын дотор бэлтгэж, холбогдох ПГУ-ын урвалын системд нэмж болно.
Жич:
Лизисийн арга нь илүү сайн илрүүлэх нөлөөтэй бөгөөд олж авсан бүтээгдэхүүнийг олон илрүүлэх урвалд ашиглаж болно.
5.1: Навчны шууд ПГУ
Гарын авлагын зургийн хэмжээгээр 2-3мм диаметртэй навчны эдийг огтолж, ПГУ-ын урвалын системд хийнэ.
Анхаарна уу: Навчны хэсгүүдийг ПГУ-ын урвалын уусмалд бүрэн дүрж, навчны эдийг хэт их хэмжээгээр нэмж болохгүй.
5.2: Навч задрах арга
5-7мм диаметртэй навчны эдийг хайчилж, центрифугийн хоолойд хийнэ.Хэрэв та боловсорч гүйцсэн навчийг сонговол навчны гол судлын эдийг ашиглахаас зайлсхий.Пипеткээр 50ul Buffer P1 лизатыг центрифугийн хоолойд хийж, навчны эдийг бүрэн дүрж, дулааны циклатор эсвэл металл ваннд хийж, 95°С-т 5-10 минутын турш задлана.
50ul Buffer P2 саармагжуулах уусмал нэмээд сайтар холино.Үүссэн лизатыг загвар болгон ашиглаж, ПГУ-ын урвалын системд нэмж болно.
Тайлбар: Загварын хэмжээ нь ПГУ-ын системийн 5-10% байх ёстой бөгөөд 20% -иас хэтрэхгүй байх ёстой (жишээ нь, 20μl ПГУ-ын системд 1-2μl лизисын буфер, 4μl-ээс ихгүй).
Алхам 6: ПГУ-ын урвал
ПГУ-ын урвалын хоолойг центрифуг хийсний дараа олшруулах зорилгоор ПГУ-ын хэрэгсэлд хийнэ.
Жич:
Урвал нь олшруулахдаа цэвэршүүлээгүй загварыг ашигладаг тул олшруулах циклийн тоо нь цэвэршүүлсэн ДНХ загварыг ашиглахтай харьцуулахад 5-10 циклээр илүү байдаг.
Алхам 7: Электрофорез илрүүлэх, үр дүнд дүн шинжилгээ хийх
M: 100bp ДНХ шат
1\4: Цэвэршүүлсэн ДНХ-ийн арга
2\5: Шууд ПГУ-ын арга
3\6: Хоосон удирдлага
Чанарын шалгалт:
Туршилтанд тохируулсан янз бүрийн хяналтын туршилтын үр дүн нь дараах нөхцлийг хангасан байх ёстой.Үгүй бол асуудлын шалтгааныг шинжилж, асуудлыг арилгасны дараа дахин шинжилгээг хийх шаардлагатай.
Хүснэгт 1. Төрөл бүрийн хяналтын бүлгийн туршилтын хэвийн үр дүн
* Плазмидыг эерэг хяналт болгон ашиглах үед эндоген генийн шинжилгээний үр дүн сөрөг байж болно
Үр дүнгийн дүгнэлт:
A. Дээжний эндоген генийн шинжилгээний хариу сөрөг гарсан нь дээжээс энгийн ПГУ илрүүлэхэд тохиромжтой ДНХ-г гаргаж авах боломжгүй буюу гаргаж авсан ДНХ нь ПГУ-ын урвалын дарангуйлагч агуулсан тул ДНХ-ийг дахин гаргаж авах шаардлагатайг харуулж байна.
B. Дээжний эндоген генийн шинжилгээний хариу эерэг, экзоген генийн шинжилгээний хариу сөрөг гарсан нь дээжээс энгийн ПГУ илрүүлэхэд тохиромжтой ДНХ-г гаргаж авсан болохыг харуулж байгаа бөгөөд дээжээс ХХХ ген илрээгүй гэж дүгнэж болно.
C. Дээжний эндоген генийн шинжилгээний хариу эерэг, экзоген генийн шинжилгээний хариу эерэг гарсан нь дээжээс энгийн ПГУ-ын илрүүлэхэд тохиромжтой ДНХ гаргаж авсан, дээжийн ДНХ-д ХХХ ген агуулагдаж байна.Баталгаажуулах туршилтыг цаашид хийж болно.
Алхам 8: Илрүүлэх праймерыг зохион бүтээх
Туршилтын дараа 2% натрийн гипохлоритын уусмал, 70% этанолын уусмалаар туршилтын талбайг арчиж, орчны бохирдлоос сэргийлнэ.
Хавсралт
Хүснэгт 2. Генийн өөрчлөлттэй ургамлын ПГУ-ын ерөнхий илрүүлэхэд түгээмэл хэрэглэгддэг праймерууд
Лавлах баримт бичиг:
SN/T 1202-2010, Хүнсний бүтээгдэхүүн дэх генийн өөрчлөлттэй ургамлын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн чанарын ПГУ-ыг илрүүлэх арга.
Хөдөө аж ахуйн яамны мэдэгдэл 1485-5-2010, Генетикийн өөрчлөлттэй ургамал, тэдгээрийн бүтээгдэхүүн-будаа M12 ба түүний деривативын найрлага дахь туршилт.
Шуудангийн цаг: 2021 оны 6-р сарын 09-ний өдөр
