一、 Урвалын системийн мэдрэмжийг нэмэгдүүлэх:

1. Өндөр чанарын РНХ-г тусгаарлах:

Амжилттай cDNA синтез нь өндөр чанартай РНХ-ээс үүсдэг.Өндөр чанартай РНХ нь хамгийн багадаа бүрэн хэмжээний байх ёстой бөгөөд EDTA эсвэл SDS зэрэг урвуу транскриптазын дарангуйлагчгүй байх ёстой.РНХ-ийн чанар нь таны cDNA руу хуулж болох дарааллын мэдээллийн дээд хэмжээг тодорхойлдог.РНХ цэвэршүүлэх нийтлэг арга бол гуанидин изотиоцианат/хүчил фенол ашиглан нэг алхамт арга юм.RNase-ийн ул мөр хэмжээгээр бохирдохоос урьдчилан сэргийлэхийн тулд RNase-ээр баялаг дээжээс (нойр булчирхай гэх мэт) тусгаарлагдсан РНХ-ийг өндөр чанартай РНХ, ялангуяа удаан хугацаагаар хадгалахын тулд формальдегид дотор хадгалах шаардлагатай.Хархны элэгнээс гаргаж авсан РНХ нь усанд нэг долоо хоног хадгалагдсаны дараа үндсэндээ задарсан бол хархны дэлүүнээс гаргаж авсан РНХ нь усанд 3 жил хадгалагдсаны дараа тогтвортой байсан.Нэмж дурдахад, 4 кб-ээс урт хуулбар нь жижиг хуулбараас илүү ул мөр RNase-ийн задралд илүү мэдрэмтгий байдаг.Хадгалсан РНХ дээжийн тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд РНХ-ийг ионгүйжүүлсэн формамидын уусмалд уусгаж, -70 хэмд хадгалж болно.РНХ-г хадгалахад ашигладаг формамид нь РНХ-ийг задалдаг хог хаягдлаас ангид байх ёстой.Нойр булчирхайн РНХ нь формамидад дор хаяж нэг жил хадгалагдах боломжтой.РНХ-г хэрэглэхээр бэлдэж байхдаа РНХ-ийг тунадасжуулах дараах аргыг хэрэглэж болно: NaCl-ийг 0.2М болон 4 дахин их хэмжээний этилийн спирт нэмээд тасалгааны температурт 3-5 минут байлгаад 10000×г-т 5 минутын турш центрифуг хийнэ.

2. RNaseH-идэвхгүй (RNaseH-) урвуу транскриптазыг ашиглана:

cDNA синтезийн урт, гарцыг нэмэгдүүлэхийн тулд урвуу транскрипцийн урвалд RNase дарангуйлагчдыг ихэвчлэн нэмдэг.RNase дарангуйлагчийг буфер ба бууруулагч бодис (DTT гэх мэт) байлцуулан эхний хэлхээний синтезийн урвалын үед нэмэх хэрэгтэй, учир нь cDNA синтезийн өмнөх процесс нь дарангуйлагчийг денатурат болгож, улмаар РНХ-г задлах боломжтой холбоотой RNase-ийг ялгаруулдаг.Уургийн RNase дарангуйлагчид нь зөвхөн RNase A, B, C-ээр РНХ-ийн задралаас сэргийлж, арьсанд RNase-аас сэргийлдэггүй тул эдгээр дарангуйлагчийг хэрэглэж байсан ч RNase-ийг хуруугаараа нэвтрүүлэхээс болгоомжил.

Урвуу транскриптаза нь РНХ-ийг cDNA болгон хувиргах процессыг хурдасгадаг.M-MLV ба AMV хоёулаа өөрийн полимеразын үйл ажиллагаанаас гадна эндоген RNaseH идэвхжилтэй байдаг.RNaseH идэвхжил ба полимеразын идэвхжил нь РНХ загвар ба ДНХ праймер буюу cDNA өргөтгөлийн хэлхээний хооронд үүссэн эрлийз хэлхээний төлөө хоорондоо өрсөлдөж, РНХ:ДНХ-ийн цогцолбор дахь РНХ хэлхээг доройтуулдаг.RNaseH-ийн идэвхжилээр доройтсон РНХ загвар нь cDNA синтезийн үр дүнтэй субстрат болж чадахаа больсон бөгөөд энэ нь cDNA синтезийн гарц болон уртыг бууруулдаг.Тиймээс урвуу транскриптазын RNaseH идэвхийг арилгах эсвэл их хэмжээгээр бууруулах нь ашигтай байх болно.

SuperScript Ⅱ урвуу транскриптаза, RNaseH-MMLV урвуу транскриптаза ба термоскрипт урвуу транскриптаза, RNaseH-AMV нь MMLV ба AMV-ээс илүү их хэмжээний, илүү бүрэн хэмжээний cDNA авах боломжтой.RT-ПГУ-ын мэдрэмжинд cDNA синтезийн хэмжээ нөлөөлнө.ThermoScript нь AMV-ээс хамаагүй илүү мэдрэмтгий байдаг.RT-ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээ нь урвуу транскриптазын cDNA-г нэгтгэх чадвараар хязгаарлагддаг, ялангуяа том cDNA-г клончлох үед.MMLV-тэй харьцуулахад SuperScripⅡ нь урт RT-ПГУ-ын бүтээгдэхүүний гарцыг ихээхэн нэмэгдүүлсэн.RNaseH-урвуу транскриптаза нь термостатыг ихэсгэдэг тул урвалыг ердийн 37-42 ° C-аас өндөр температурт хийж болно.Санал болгож буй синтезийн нөхцөлд олиго(dT) праймер ба 10 μCi [α-P]dCTP ашиглана.Эхний хэлхээний нийт ургацыг TCA хур тунадасны аргыг ашиглан тооцоолсон.Бүрэн урттай cDNA-г хэмжээсээр ангилсан туузыг ашиглан шинжилж, шүлтлэг агароз гель дээр тоолсон.

3. Урвуу хуулбарлахын тулд инкубацийн температурыг нэмэгдүүлэх:

Илүү өндөр инкубацийн температур нь РНХ-ийн хоёрдогч бүтцийг нээж, урвалын гарцыг нэмэгдүүлдэг.Ихэнх РНХ загваруудын хувьд РНХ болон праймерыг буфер, давсгүйгээр 65°С-т өсгөвөрлөж, дараа нь мөсөн дээр хурдан хөргөх нь ихэнх хоёрдогч бүтцийг устгаж, праймеруудыг холбох боломжийг олгоно.Гэсэн хэдий ч зарим загвар нь дулааны денатурацийн дараа ч гэсэн хоёрдогч бүтэцтэй хэвээр байна.Эдгээр хэцүү загваруудын олшруулалтыг ThermoScript урвуу транскриптаза ашиглан хийж, өсгөлтийг сайжруулахын тулд урвуу транскрипцийн урвалыг илүү өндөр температурт байрлуулж болно.Өндөр инкубацийн температур нь өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлдэг, ялангуяа генийн өвөрмөц праймеруудыг (GSP) cDNA синтез хийхэд ашигладаг (3-р бүлгийг үзнэ үү).Хэрэв GSP ашиглаж байгаа бол праймеруудын Tm нь хүлээгдэж буй инкубацийн температуртай ижил байгаа эсэхийг шалгаарай.60°С-ээс дээш температурт олиго(dT) болон санамсаргүй праймерыг бүү хэрэглээрэй.Санамсаргүй праймерыг 60 ° C хүртэл өсгөхийн өмнө 25 ° C-т 10 минутын турш өсгөвөрлөх шаардлагатай.Урвуу транскрипцийн өндөр температурыг ашиглахаас гадна РНХ/праймерын хольцыг 65°С-ийн денатурацийн температураас урвуу транскрипцийн инкубацийн температурт шууд шилжүүлж, урьдчилан халаасан 2 × урвалын хольцыг (cDNA халуун эхлүүлэх синтез) нэмснээр өвөрмөц чанарыг сайжруулж болно.Энэ арга нь бага температурт үүсдэг молекул хоорондын суурийн хослолоос урьдчилан сэргийлэхэд тусалдаг.RT-PCR-д шаардлагатай олон температурын сэлгэлтийг дулааны циклийг ашиглан хялбаршуулж болно.

Tth термостат полимераз нь Mg2+-ийн дэргэд ДНХ полимераза, Mn2+-ийн дэргэд РНХ полимеразын үүрэг гүйцэтгэдэг.Үүнийг хамгийн ихдээ 65 ° C температурт дулаацуулж болно.Гэвч ПГУ-ын үед Mn2+ байгаа нь үнэнч байдлыг бууруулдаг бөгөөд энэ нь Tth полимеразыг cDNA-г клончлох зэрэг өндөр нарийвчлалтай олшруулахад тохиромжгүй болгодог.Нэмж дурдахад Tth нь урвуу транскрипцийн үр ашиг багатай бөгөөд энэ нь мэдрэмжийг бууруулдаг ба урвуу транскрипц болон ПГУ-ыг нэг ферментээр гүйцэтгэх боломжтой тул урвуу транскрипцгүй хяналтын урвалыг геномын ДНХ-тэй бохирдуулсан cDNA олшруулах бүтээгдэхүүнийг харьцуулах боломжгүй юм.Олшруулах бүтээгдэхүүнийг салгасан.

4. Урвуу транскрипцийг дэмждэг нэмэлтүүд:

Глицерол, DMSO зэрэг нэмэлтүүд нь нуклейн хүчлийн хоёр хэлхээний тогтвортой байдлыг бууруулж, РНХ-ийн хоёрдогч бүтцийг тайлж чадах эхний хэлхээний синтезийн урвалд нэмдэг.SuperScript II эсвэл MMLV-ийн үйл ажиллагаанд нөлөөлөхгүйгээр 20% хүртэл глицерин эсвэл 10% DMSO нэмж болно.AMV нь үйл ажиллагааны алдагдалгүйгээр 20% хүртэл глицериныг тэсвэрлэдэг.SuperScriptⅡ урвуу транскрипцийн урвал дахь RT-PCR-ийн мэдрэмжийг нэмэгдүүлэхийн тулд 10% глицерин нэмж, 45°С-т өсгөвөрлөх боломжтой.Хэрэв урвуу транскрипцийн урвалын бүтээгдэхүүний 1/10-ийг ПГУ-д нэмбэл олшруулах урвал дахь глицеролын концентраци 0.4% байгаа нь ПГУ-ыг дарангуйлахад хангалтгүй юм.

5. RNaseH эмчилгээ:

ПГУ-аас өмнө cDNA синтезийн урвалыг RNaseH-ээр эмчлэх нь мэдрэмжийг нэмэгдүүлдэг.Зарим загваруудын хувьд cDNA синтезийн урвал дахь РНХ нь олшруулах бүтээгдэхүүнийг холбохоос сэргийлдэг гэж үздэг бөгөөд энэ тохиолдолд RNaseH эмчилгээ нь мэдрэмжийг нэмэгдүүлдэг.Ерөнхийдөө RNaseH эмчилгээ нь бага хуулбартай булцууны скероз II гэх мэт урт бүрэн хэмжээний cDNA зорилтот загваруудыг өсгөхөд шаардлагатай байдаг.Энэхүү хэцүү загварын хувьд RNaseH эмчилгээ нь SuperScript II эсвэл AMV-нийлэгжүүлсэн cDNA-ийн үүсгэсэн дохиог сайжруулсан.RT-ПГУ-ын ихэнх урвалын хувьд RNaseH эмчилгээ нь сонголттой байдаг, учир нь 95°С-ийн ПГУ-ын денатурацийн үе шат нь ерөнхийдөө РНХ:ДНХ-ийн цогцолбор дахь РНХ-ийг гидролиз болгодог.

6. Жижиг РНХ илрүүлэх аргыг сайжруулах:

Зөвхөн бага хэмжээний РНХ байгаа тохиолдолд RT-ПГУ нь ялангуяа хэцүү байдаг.РНХ тусгаарлах явцад зөөвөрлөгч болгон нэмсэн гликоген нь жижиг дээжийн гарцыг нэмэгдүүлэхэд тусалдаг.RNase-гүй гликогенийг Тризол нэмэхтэй зэрэгцүүлэн нэмж болно.Гликоген нь усанд уусдаг бөгөөд дараа нь хур тунадас үүсэхэд туслахын тулд РНХ-тэй усан үе шатанд байлгаж болно.50 мг-аас бага эд эс буюу 106 өсгөвөрлөсөн эсийн дээжийн хувьд RNase-гүй гликогенийн санал болгож буй концентраци нь 250 мкг/мл байна.

SuperScript II ашиглан урвуу транскрипцийн урвалд ацетилжуулсан BSA нэмэх нь мэдрэмжийг нэмэгдүүлж, бага хэмжээний РНХ-ийн хувьд SuperScript II-ийн хэмжээг бууруулж, 40 нэгж RNaseOut нуклеаза дарангуйлагч нэмэх нь илрүүлэх түвшинг нэмэгдүүлдэг.Хэрэв гликогенийг РНХ тусгаарлах процесст ашигладаг бол урвуу транскрипцийн урвалд SuperScript II-г ашиглахдаа BSA эсвэл RNase дарангуйлагчийг нэмэхийг зөвлөж байна.

、RT-ПГУ-ын өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэх

1. CND асинтез:

Эхний хэлхээний cDNA синтезийг гурван өөр аргыг ашиглан эхлүүлж болох бөгөөд харьцангуй өвөрмөц байдал нь нийлэгжсэн cDNA-ийн хэмжээ, төрөлд нөлөөлдөг.

Санамсаргүй праймер арга нь гурван аргын хамгийн бага өвөрмөц арга байсан.Праймерууд транскриптийн туршид олон цэгт наалдаж, богино, хэсэгчилсэн урттай cDNA үүсгэдэг.Энэ аргыг ихэвчлэн урвуу транскриптазаар хуулбарлах боломжгүй хоёрдогч бүтэцтэй эсвэл төгсгөлийн цэг бүхий РНХ-ийн загваруудаас 5′ төгсгөлийн дарааллыг олж авах, cDNA авахад ашигладаг.Хамгийн урт cDNA-г авахын тулд РНХ-ийн дээж бүрийн праймер ба РНХ-ийн харьцааг эмпирик байдлаар тодорхойлох шаардлагатай.Санамсаргүй праймеруудын анхны концентраци нь 20 мкл урвал тутамд 50-250 нг хооронд хэлбэлздэг.Санамсаргүй праймер ашиглан нийт РНХ-ээс нийлэгжүүлсэн cDNA нь гол төлөв рибосомын РНХ байдаг тул ерөнхийдөө поли(А)+РНХ-ийг загвар болгон сонгодог.

Oligo(dT) праймерууд санамсаргүй праймеруудаас илүү өвөрмөц байдаг.Энэ нь ихэнх эукариот мРНХ-ийн 3′ төгсгөлд байрлах поли(А) сүүл рүү эрлийзждэг.Поли(А)+ РНХ нь нийт РНХ-ийн ойролцоогоор 1%-2%-ийг эзэлдэг тул cDNA-ийн хэмжээ, нарийн төвөгтэй байдал нь санамсаргүй праймеруудаас хамаагүй бага байдаг.Өвөрмөц чанар өндөр учраас олиго(dT) нь ерөнхийдөө РНХ ба праймерын харьцааг оновчтой болгох, поли(А)+ сонгох шаардлагагүй.20μl урвалын системд 0.5μg олиго(дТ) хэрэглэхийг зөвлөж байна.oligo(dT)12-18 нь ихэнх RT-PCR-д тохиромжтой.ThermoScript RT-PCR систем нь өндөр инкубацийн температурт илүү сайн дулааны тогтвортой байдлын улмаас олиго(dT)20-ийг санал болгодог.

Генийн өвөрмөц праймерууд (GSP) нь урвуу транскрипцийн үе шатанд хамгийн өвөрмөц праймерууд юм.GSP нь санамсаргүй праймер буюу олиго(dT)-аас ялгаатай нь бүх РНХ-д холбогддог РНХ-ийн зорилтот дараалалд тусгайлан эрлийзжих чадвартай антисенс олигонуклеотид юм.ПГУ-ын праймерыг боловсруулахад ашигладаг ижил дүрмүүд нь урвуу транскрипцийн урвал дахь GSP-ийн загварт хамаарна.GSP нь мРНХ-ийн 3′-хамгийн төгсгөлд бэхлэгддэг олшруулалтын праймертай ижил дараалалтай байж болно, эсвэл GSP нь урвуу олшруулалтын праймерын доод урсгалыг холбоход зориулагдсан байж болно.Зарим олшруулсан субъектуудын хувьд нэгээс илүү антисенс праймерыг амжилттай RT-PCR хийх шаардлагатай, учир нь зорилтот РНХ-ийн хоёрдогч бүтэц нь праймерыг холбохоос сэргийлдэг.1 pmol antisense GSP-ийг 20 мкл эхний хэлхээний синтезийн урвалд хэрэглэхийг зөвлөж байна.

2. Урвуу хуулбарлахын тулд инкубацийн температурыг нэмэгдүүлэх:

GSP-ийн өвөрмөц байдлын давуу талыг бүрэн ашиглахын тулд илүү өндөр термостаттай урвуу транскриптазыг ашиглах хэрэгтэй.Термостат урвуу транскриптазыг өндөр температурт өсгөвөрлөж, урвалын хатуу байдлыг нэмэгдүүлэх боломжтой.Жишээлбэл, хэрэв GSP нь 55 ° C-т шатдаг бол AMV эсвэл M-MLV нь 37 ° C-ийн бага хатуулагтай урвуу транскрипцид ашиглагддаг бол GSP-ийн өвөрмөц чанарыг бүрэн ашиглахгүй.Гэсэн хэдий ч SuperScript II болон ThermoScript нь 50 ° C ба түүнээс дээш температурт урвалд орох боломжтой бөгөөд энэ нь бага температурт үүссэн өвөрмөц бус бүтээгдэхүүнийг устгах болно.Хамгийн их өвөрмөц байдлыг хангахын тулд РНХ/праймер хольцыг 65°С-ийн денатурацийн температураас урвуу транскрипцийн инкубацийн температурт шууд шилжүүлж, урьдчилан халаасан 2 × урвалын холимогт (cDNA синтезийн халуун эхлэл) нэмж болно.Энэ нь бага температурт молекул хоорондын баазын хослолоос урьдчилан сэргийлэхэд тусалдаг.RT-PCR-д шаардагдах олон температурын шилжилтийг дулааны циклер ашиглан хялбарчилж болно.

3. Геномын ДНХ-ийн бохирдлыг бууруулдаг:

RT-ПГУ-д учирч болзошгүй хүндрэл нь РНХ дахь геномын ДНХ-ийн бохирдол юм.Trizol Reagent гэх мэт РНХ тусгаарлах сайн аргыг хэрэглэснээр РНХ бэлдмэлийг бохирдуулж буй геномын ДНХ-ийн хэмжээг бууруулна.Геномын ДНХ-ээс гаргаж авсан бүтээгдэхүүнээс зайлсхийхийн тулд урвуу транскрипцээс өмнө бохирдуулагч ДНХ-г арилгахын тулд РНХ-ийг олшруулах зэрэглэлийн DNase I-ээр эмчилж болно.ДНаз I-ийн задрал нь дээжийг 2.0 мм EDTA-д 65°С-т 10 минутын турш өсгөвөрлөх замаар дуусгавар болсон.EDTA нь магнийн ионуудыг хелатжуулж, өндөр температурт магнийн ионоос хамааралтай РНХ-ийн гидролизээс сэргийлдэг.

Олшруулсан cDNA-г бохирдуулсан геномын ДНХ-ийн олшруулалтын бүтээгдэхүүнээс салгахын тулд праймер бүрийг экзоныг тусгаарлахаар зохион бүтээж болно.cDNA-аас гаргаж авсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн нь бохирдсон геномын ДНХ-ээс гаргаж авсан бүтээгдэхүүнээс богино байх болно.Түүнчлэн, өгөгдсөн фрагмент нь геномын ДНХ эсвэл cDNA-аас гаралтай эсэхийг тодорхойлохын тулд РНХ-ийн загвар бүр дээр урвуу транскрипцгүй хяналтын туршилтыг хийсэн.Урвуу транскрипцгүйгээр олж авсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн нь геномоос гаралтай.