Ⅰ. Урвалын системийн мэдрэмжийг нэмэгдүүлэх:
1. Өндөр чанартай РНХ-г салга:
Амжилттай cDNA синтез нь өндөр чанартай РНХ-ээс үүсдэг.Өндөр чанартай РНХ нь EDTA эсвэл SDS зэрэг бичлэгийн фермент агуулаагүй дарангуйлагчийг агуулаагүй байх ёстой.РНХ-ийн чанар нь таны cDNA-д хуулбарлаж болох дарааллын мэдээллийн хамгийн их утгыг тодорхойлдог.РНХ цэвэршүүлэх ерөнхий арга нь изооцианат/ацидофенолыг ашиглах шат дамжлагатай арга юм.RNase-ийн бохирдлоос урьдчилан сэргийлэхийн тулд RNase-ээр баялаг дээжээс (нойр булчирхай гэх мэт) тусгаарлагдсан РНХ нь өндөр чанартай РНХ-г хадгалахын тулд формальдегидийг хадгалах шаардлагатай байдаг бөгөөд энэ нь урт хугацааны хадгалалтад бүр ч илүү байдаг.Хархны элэгнээс гаргаж авсан РНХ нэг долоо хоног усанд хадгалсны дараа үндсэндээ задарсан бол хархны дэлүүнээс гаргаж авсан РНХ гурван жил усанд хадгалсны дараа тогтвортой байсан.Нэмж дурдахад, 4кб-ээс их хэмжээтэй хуулбар нь жижиг хуулбараас илүү RNase задралд илүү мэдрэмтгий байдаг.Хадгалах РНХ дээжийн тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд РНХ-ийг ионы метальмаминд уусгаж, -70 хэмд хадгална.РНХ-г хадгалахад ашигладаг thylide нь РНХ-г задалдаг төрөл бүрийн объект агуулаагүй байх ёстой.Нойр булчирхайгаас гаргаж авсан РНХ нь метальмаминд дор хаяж нэг жил хадгалагдах боломжтой.Та РНХ-г хэрэглэхэд бэлэн болмогц РНХ-г тунадасжуулах дараах аргуудыг хэрэглэж болно: NaCl-ийг 0.2м, этанолыг 4 дахин их хэмжээгээр нэмж, өрөөний температурт 3-5 минут байлгаж, 10,000 × г төвөөс зугтах аргаар 5 минут байлгана.
2. RNaseH идэвхгүй урвуу транскриптазыг ашиглах (RNaseH-):
cDNA синтезийн урт, гарцыг нэмэгдүүлэхийн тулд урвуу транскрипцийн урвалд RNase дарангуйлагчдыг ихэвчлэн нэмдэг.RNase дарангуйлагчийг эхний гинжин синтезийн урвалд DTT гэх мэт буфер болон бууруулагч бодисуудын оролцоотойгоор нэмнэ, учир нь cDNA-ийн өмнөх синтезийн процесс нь дарангуйлагчийг денатуражуулж, улмаар РНХ-г задалдаг RNase-ийг ялгаруулдаг.Уургийн RNase дарангуйлагч нь зөвхөн RNase A, B, C-ээр РНХ задрахаас сэргийлж, арьсан дээрх RNase-аас сэргийлдэггүй тул эдгээр дарангуйлагчийг хэрэглэж байгаа ч RNase-ийг хуруугаараа нэвтрүүлэхгүй байхыг анхаарах хэрэгтэй.
Урвуу транскриптаза нь РНХ-ийг cDNA болгон хувиргах процессыг хурдасгадаг.M-MLV ба AMV хоёулаа өөрийн полимеразын үйл ажиллагаанаас гадна эндоген RNaseH идэвхжилтэй байдаг.RNaseH идэвхжил нь РНХ загвар ба ДНХ праймер эсвэл cDNA өргөтгөлийн хэлхээний хооронд үүссэн гетерозигот хэлхээний хувьд полимеразын үйл ажиллагаатай өрсөлдөж, РНХ: ДНХ-ийн нэгдэл дэх РНХ хэлхээг задалдаг.RNaseH-ийн идэвхжилээр доройтсон РНХ-ийн загваруудыг cDNA синтезийн үр дүнтэй субстрат болгон ашиглах боломжгүй болж, cDNA синтезийн гарц болон уртыг багасгадаг.Тиймээс урвуу транскриптазын RNaseH идэвхийг арилгах эсвэл их хэмжээгээр бууруулах нь маш их ашиг тустай байх болно.
SuperScriptⅡ урвуу транскриптаза, RNaseH-ийн MMLV урвуу транскриптаза- ба термоскрипт урвуу транскриптаза, RNaseH-ийн AMV- нь MMLV ба AMV-ээс илүү бүрэн хэмжээний cDNA-г гаргаж өгсөн.RT-ПГУ-ын мэдрэмжид нийлэгжсэн cDNA-ийн хэмжээ нөлөөлдөг.ThermoScript нь AMV-ээс хамаагүй илүү мэдрэмтгий байдаг.RT-ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээ нь урвуу транскриптазын cDNA-г нэгтгэх чадвараар хязгаарлагддаг, ялангуяа том Cdnas-ийг клончлох үед.MMLV-тэй харьцуулахад SuperScripⅡ нь урт RT-ПГУ-ын бүтээгдэхүүний гарцыг ихээхэн нэмэгдүүлсэн.RNaseH-ийн урвуу транскриптаза нь дулааны тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлдэг тул урвалыг хэвийн хэмжээнээс 37-42 хэмээс өндөр температурт явуулж болно.Санал болгож буй синтезийн нөхцөлд олиго(dT) праймер болон 10μCi [alpha-p]dCTP ашигласан.Эхний гинжин хэлхээний нийт үйлдвэрлэлийг TCA хур тунадасны аргаар тооцоолсон.Бүрэн урттай cDNA-д шинжилгээг хэмжээгээр ангилсан туузыг зайлуулж, шүлтлэг агароз гель дотор тоолсон.
3. Урвуу транскрипцийн дулаан хадгалах температурыг нэмэгдүүлэх:
Илүү өндөр температур нь РНХ-ийн хоёрдогч бүтцийг нээж, урвалын гарцыг нэмэгдүүлэхэд тусалдаг.Ихэнх РНХ загваруудын хувьд РНХ болон праймерыг буфер, давсгүйгээр 65°С хэмд барьж, дараа нь мөсөн дээр хурдан хөргөх нь ихэнх хоёрдогч бүтцийг устгаж, праймеруудыг холбох боломжийг олгодог.Гэсэн хэдий ч зарим загвар нь дулааны денатурацийн дараа ч гэсэн хоёрдогч бүтэцтэй хэвээр байна.Эдгээр хэцүү загваруудын олшруулалтыг ThermoScript урвуу транскриптаза ашиглан хийж, өсгөлтийг сайжруулахын тулд урвуу транскриптазын урвалыг илүү өндөр температурт байрлуулж болно.Илүү өндөр температур нь генийн өвөрмөц праймер (GSPS) ашиглан cDNA синтез хийх үед өвөрмөц чанарыг нэмэгдүүлдэг (3-р бүлгийг үзнэ үү).Хэрэв GSP ашиглаж байгаа бол праймерын Tm утга нь хүлээгдэж буй барих температуртай ижил байгаа эсэхийг шалгаарай.60 хэмээс дээш температурт олиго(dT) болон санамсаргүй праймерыг бүү ашигла.Санамсаргүй праймерыг 60 хэм хүртэл нэмэгдүүлэхийн өмнө 25 хэмд 10 минутын турш барих шаардлагатай.Урвуу транскрипцийн өндөр температурыг ашиглахаас гадна РНХ/праймерын хольцыг 65℃ денатурацийн температураас урвуу транскрипцийг хадгалах температур руу шууд шилжүүлж, урьдчилан халаасан 2x урвалын хольцыг (cDNA-ийн дулаан эхлүүлэх синтез) нэмснээр өвөрмөц чанарыг сайжруулж болно.Энэ арга нь бага температурт үүсдэг молекул хоорондын суурийн хослолоос урьдчилан сэргийлэхэд тусалдаг.ПГУ-ын багажийг ашиглах нь RT-PCR-д шаардлагатай олон тооны температурын унтраалгыг хялбаршуулдаг.
Дулаан тогтворжсон полимераз нь Mg2+, РНХ полимераза Mn2+ байгаа үед ДНХ полимеразын үүрэг гүйцэтгэдэг.Энэ нь 65 хэм хүртэл дулааныг тэсвэрлэх чадвартай.Гэсэн хэдий ч ПГУ-ын үед Mn2+ байгаа нь үнэнч байдлыг бууруулдаг бөгөөд энэ нь Tth полимеразыг cDNA клончлох гэх мэт өндөр нарийвчлалтай олшруулахад тохиромжгүй болгодог.Үүнээс гадна Tth нь урвуу транскрипцэд үр ашиг багатай бөгөөд энэ нь мэдрэмжийг бууруулдаг бөгөөд нэг фермент урвуу транскрипц болон ПГУ-ыг гүйцэтгэх чадвартай тул урвуу транскрипцгүй хяналтын урвалыг cDNA-ийн олшруулсан бүтээгдэхүүнийг бохирдсон геномын ДНХ-ийн бүтээгдэхүүнээс ялгахад ашиглах боломжгүй юм.
4. Урвуу транскрипцийг дэмждэг нэмэлт:
Эхний гинжин нийлэгжилтийн урвалд глицерин, DMSO зэрэг нэмэлт бодисуудыг нэмснээр нуклейн хүчлийн давхар хэлхээний тогтвортой байдлыг бууруулж, РНХ-ийн хоёрдогч бүтцийг задлах боломжтой.SuperScriptⅡ эсвэл MMLV-ийн үйл ажиллагаанд нөлөөлөхгүйгээр 20% хүртэл глицерин эсвэл 10% DMSO нэмж болно.AMV нь үйл ажиллагааг бууруулалгүйгээр 20% хүртэл глицериныг тэсвэрлэдэг.SuperScriptⅡ урвуу транскрипцийн урвал дахь RT-PCR-ийн мэдрэмжийг нэмэгдүүлэхийн тулд 10% глицерин нэмж, 45℃ температурт тусгаарлаж болно.Хэрэв дахин Транскрипцийн урвалын бүтээгдэхүүний 1/10-ийг ПГУ-д нэмбэл олшруулах урвал дахь глицеринийн концентраци 0.4% байгаа нь ПГУ-ыг дарангуйлахад хангалтгүй юм.
5. RNaseH боловсруулалт:
ПГУ-аас өмнө cDNA синтезийн урвалыг RNaseH-ээр эмчилснээр мэдрэг чанарыг сайжруулж болно.Зарим загваруудын хувьд cDNA синтезийн урвал дахь РНХ нь олшруулсан бүтээгдэхүүнийг холбохоос сэргийлдэг гэж үздэг бөгөөд энэ тохиолдолд RNaseH эмчилгээ нь мэдрэмжийг нэмэгдүүлдэг.Ерөнхийдөө бага хуулбартай булцууны скерозⅡ гэх мэт харьцангуй урт бүрэн хэмжээний cDNA зорилтот загварыг олшруулахад RNaseH эмчилгээ шаардлагатай.Энэхүү хэцүү загварын хувьд RNaseH нь SuperScriptⅡ эсвэл AMV-ээр нийлэгжсэн cDNA-ийн үүсгэсэн дохиог сайжруулсан.Ихэнх RT-ПГУ-ын урвалын хувьд RNaseH эмчилгээ нь сонголттой байдаг, учир нь 95℃ тусгаарлагдсан ПГУ-ын денатурацийн үе шат нь РНХ: ДНХ-ийн цогцолбороос РНХ-г гидролиз болгодог.
6. Бага хэмжээний РНХ илрүүлэх аргууд:
Зөвхөн бага хэмжээний РНХ байгаа тохиолдолд RT-PCR нь ялангуяа хэцүү байдаг.РНХ-ийг салгах явцад гликогенийг тээвэрлэгч болгон нэмэх нь жижиг дээжийн гарцыг нэмэгдүүлэхэд тусалдаг.RNase-гүй гликогенийг Trizol-тай нэгэн зэрэг нэмж болно.Гликоген нь усанд уусдаг бөгөөд РНХ-тэй усны үе шатанд үлдэж, дараагийн хур тунадас үүсэхэд тусалдаг.RNase агуулаагүй гликогенийн санал болгож буй концентраци нь 50 мг-аас бага эд эс эсвэл 106 өсгөвөрлөсөн эсийн дээжийн хувьд 250 мкг/мл байна.
SuperScriptⅡ ашиглан урвуу транскрипцийн урвалд ацетилжуулсан BSA нэмэх нь мэдрэмжийг нэмэгдүүлж, бага хэмжээний РНХ-ийн хувьд SuperScriptⅡ-ийн хэмжээг бууруулж, 40 нэгж RnaseOut нуклеаза дарангуйлагч нэмэх нь илрүүлэх түвшинг сайжруулна.Хэрэв гликогенийг РНХ-г салгахад ашигладаг бол SuperScriptⅡ ашиглан урвуу транскрипцийн урвалыг хийхийн тулд BSA эсвэл RNase дарангуйлагчийг нэмэхийг зөвлөж байна.
Ⅱ. RT-ПГУ-ын өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэх
1. cNDA синтез:
Эхний хэлхээний cDNA нийлэгжилтийг эхлүүлэхийн тулд гурван өөр аргыг ашиглаж болох ба аргын харьцангуй өвөрмөц байдал нь нийлэгжсэн cDNA-ийн хэмжээ, төрөлд нөлөөлдөг.
Санамсаргүй праймер арга нь гурван аргын хамгийн бага өвөрмөц арга юм.Богино, хэсэгчилсэн урттай cDNA-г үүсгэхийн тулд праймеруудыг транскриптийн туршид олон хэсэгт холбодог.Энэ аргыг ихэвчлэн хоёрдогч бүтцийн бүсүүдтэй эсвэл урвуу транскриптаза хуулбарлах боломжгүй төгсгөлийн хэсгүүдтэй РНХ-ийн загваруудаас 5′ терминалын дараалал ба cDNA-г авахад ашиглагддаг.Хамгийн урт cDNA-г авахын тулд РНХ-ийн дээж бүрийн праймер ба РНХ-ийн харьцааг эмпирик байдлаар тодорхойлох шаардлагатай.Санамсаргүй праймерын анхны концентраци нь 20μl урвалын системд 50-250 нг хооронд хэлбэлздэг.Санамсаргүй праймер ашиглан нийт РНХ-ээс нийлэгжүүлсэн cDNA нь голчлон рибосомын РНХ байдаг тул ерөнхийдөө поли(А)+РНХ-ийг загвар болгон сонгодог.
Oligo(dT) эхлэл нь санамсаргүй праймераас илүү өвөрмөц юм.Ихэнх эукариот эсийн мРНХ-ийн 3′ төгсгөлд байрлах поли(А) сүүлтэй эрлийзждэг.Поли(А)+РНХ нь нийт РНХ-ийн 1-2%-ийг эзэлдэг тул cDNA-ийн хэмжээ, нарийн төвөгтэй байдал нь санамсаргүй праймер ашигласантай харьцуулахад хамаагүй бага байдаг.Өвөрмөц чанар өндөр учраас олиго(dT) нь ерөнхийдөө РНХ ба праймерын харьцаа болон поли(А)+ сонголтын оновчтой болгох шаардлагагүй.20μl урвалын системд 0.5μg олиго(дТ) хэрэглэхийг зөвлөж байна.oligo(dT)12-18 нь ихэнх RT-PCR-д тохиромжтой.ThermoScript RT-PCR систем нь дулааны тогтвортой байдал сайтай учир олиго(dT)20-ыг хангадаг бөгөөд өндөр температурт хадгалахад тохиромжтой.
Генийн өвөрмөц праймерууд (GSP) нь урвуу транскрипцийн үе шатанд хамгийн сайн тусгай праймерууд юм.GSP нь санамсаргүй праймер эсвэл олиго(dT) гэх мэт бүх Рна-г задлахын оронд РНХ-ийн очих дараалалтай тусгайлан эрлийзждэг антисенс олигонуклеозид юм.ПГУ-ын праймерыг боловсруулахад ашигладаг дүрмүүд нь урвуу транскрипцийн урвалын GSP-ийн загварт мөн хамаарна.GSP нь mRNA3′-ийн төгсгөлд бэхлэгдсэн олшруулалтын праймертай ижил дараалалтай байж болно, эсвэл GSP нь урвуу олшруулалтын праймераар доод урсгалд бэхлэгддэг.Зарим олшруулсан объектын хувьд зорилтот РНХ-ийн хоёрдогч бүтэц нь праймерыг холбохоос сэргийлж болох тул амжилттай RT-PCR хийхэд нэгээс илүү антисенс праймерыг зохион бүтээх шаардлагатай.20μl-ийн анхны гинжин синтезийн урвалын системд 1pmol antisense GSP-ийг ашиглахыг зөвлөж байна.
2. Урвуу транскрипцийн дулаан хадгалах температурыг нэмэгдүүлэх:
GSP өвөрмөц чанарыг бүрэн ашиглахын тулд өндөр дулааны тогтвортой байдал бүхий урвуу транскриптазыг ашиглах хэрэгтэй.Дулаан тогтвортой урвуу транскриптазыг илүү өндөр температурт тусгаарлаж, урвалын хүчийг нэмэгдүүлэх боломжтой.Жишээлбэл, хэрэв GSP-ийг 55 ° C-т халаасан бол AMV эсвэл M-MLV ашиглан 37 ° C-д урвуу транскрипцийг бага нарийвчлалтайгаар гүйцэтгэвэл GSP-ийн өвөрмөц чанар бүрэн ашиглагдахгүй.Гэсэн хэдий ч SuperScripⅡ болон ThermoScript нь 50℃ ба түүнээс дээш температурт хариу үйлдэл үзүүлэх боломжтой бөгөөд энэ нь бага температурт үйлдвэрлэсэн өвөрмөц бус бүтээгдэхүүнийг арилгадаг.Хамгийн их өвөрмөц байдлыг хангахын тулд РНХ/праймерын хольцыг 65℃ денатурацийн температураас урвуу транскрипцийг хадгалах температур руу шууд урьдчилан халаасан 2 х урвалын хольц (cDNA синтезийн дулааны эхлэл) нэмснээр шилжүүлж болно.Энэ нь бага температурт молекулуудын хооронд суурь хослохоос сэргийлдэг.ПГУ-ын багажийг ашиглах нь RT-PCR-д шаардлагатай олон температурын шилжилтийг хялбаршуулдаг.
3. Геномын ДНХ-ийн бохирдлыг бууруулах:
RT-ПГУ-ын нэг хүндрэл нь РНХ нь геномын ДНХ-г бохирдуулдаг явдал юм.Trizol Reagent гэх мэт илүү сайн РНХ ялгах аргуудыг ашиглах нь РНХ бэлдмэл дэх геномын ДНХ-ийн бохирдлыг бууруулдаг.Геномын ДНХ-ээс үүссэн бүтээгдэхүүнээс зайлсхийхийн тулд урвуу транскрипцээс өмнө бохирдсон ДНХ-г арилгахын тулд РНХ-г олшруулах зэрэглэлийн DnasⅠ-ээр эмчилж болно.ДНазын задралыг зогсоохын тулд дээжийг 2.0 мм EDTA-д 65 хэмд 10 минут байлгана.EDTA нь өндөр температурт үүсдэг магнийн ионоос хамааралтай РНХ-ийн гидролизээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд магнийн ионуудыг хелат болгодог.
Олшруулсан cDNA-г геномын ДНХ олшруулах бүтээгдэхүүнээс салгахын тулд тусгаарлагдсан экзонтой тус тусад нь нийлдэг праймеруудыг зохион бүтээж болно.cDNA-аас гаргаж авсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн нь бохирдсон геномын ДНХ-ээс гаргаж авсан бүтээгдэхүүнээс богино байх болно.Урвуу транскрипцгүй хяналттай туршилтыг РНХ-ийн загвар бүр дээр хийж, өгөгдсөн фрагмент нь геномын ДНХ эсвэл cDNA-аас байгаа эсэхийг тодорхойлох болно.Урвуу транскрипц байхгүй үед олж авсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг геномоос гаргаж авдаг.
Холбоотой бүтээгдэхүүн
-Нэг алхамт иж бүрдэл нь урвуу транскрипц болон ПГУ-ыг нэг хоолойд хийх боломжийг олгодог.Энэ нь зөвхөн загвар РНХ, тусгай ПГУ-ын праймер болон RNase-Free ddH нэмэх шаардлагатай2O.
-РНХ-ийн бодит цагийн тоон шинжилгээг хурдан бөгөөд үнэн зөв хийх боломжтой.
-Иж бүрдэл нь Foregene урвуу транскрипцийн өвөрмөц урвалж ба Foregene HotStar Taq ДНХ Полимеразыг хосгүй урвалын системтэй хослуулан олшруулах үр ашиг, урвалын өвөрмөц байдлыг үр дүнтэй сайжруулахад ашигладаг.
-Оновчилсон урвалын систем нь урвалыг илүү мэдрэгчтэй, дулааны тогтвортой байдал, тэсвэр тэвчээртэй болгодог.
RT Easy II (GDNase-тай) GDNase-тай бодит цагийн ПГУ-ын анхны хэлхээний CDNA синтезийн мастер премикс
-2 минутын дотор загварт байгаа гДНХ-г арилгах үр дүнтэй чадвар.
-Үр ашигтай урвуу транскрипцийн систем, эхний хэлхээний cDNA-ийн нийлэгжилтийг дуусгахад ердөө 15 минут зарцуулдаг.
-Цогц загварууд: GC-ийн өндөр агуулгатай, нарийн төвөгтэй хоёрдогч бүтэцтэй загваруудыг мөн өндөр үр ашигтайгаар эргүүлж болно.
-Өндөр мэдрэмжтэй урвуу транскрипцийн систем, pg түвшний загварууд нь өндөр чанарын cDNA авах боломжтой.
-Урвуу транскрипцийн систем нь өндөр дулааны тогтвортой байдал, оновчтой урвалын температур нь 42 ℃ бөгөөд 50 ℃-т урвуу транскрипцийн сайн гүйцэтгэлтэй хэвээр байна.
Шуудангийн цаг: 2023-03-07
