1. Анхан шатны мэдлэг (туршилтын хэсгийг үзэхийг хүсвэл 2-р хэсэг рүү шууд шилжүүлнэ үү)
Ердийн ПГУ-ын дериватив урвалын хувьд Бодит цагийн ПГУ нь флюресценцийн дохионы өөрчлөлтөөр дамжуулан ПГУ-ын олшруулах урвалын мөчлөг бүрт олшруулах бүтээгдэхүүний хэмжээ өөрчлөгдөхийг голчлон хянаж, ct утга ба стандарт муруй хоорондын хамаарлын дагуу эхлэлийн загварт тоон шинжилгээ хийдэг.
RT-ПГУ-ын тусгай өгөгдөл ньсуурь, флюресценцийн босгоболонCt утга.
| суурь: | 3-15 дахь мөчлөгийн флюресценцийн утга нь хэмжилтийн үе үе алдаанаас үүдэлтэй суурь (суурь) юм. |
| Босго (босго): | Олшруулалтын муруйн экспоненциал өсөлтийн бүсэд тохирох байрлалд тогтоосон флюресценц илрүүлэх хязгаарыг хэлнэ, ерөнхийдөө суурь шугамын стандарт хазайлтаас 10 дахин их байна. |
| CT утга: | Энэ нь урвалын хоолой тус бүрийн флюресценцийн утга босгонд хүрэх үед ПГУ-ын мөчлөгийн тоо юм. Ct утга нь анхны загварын хэмжээтэй урвуу пропорциональ байна. |
RT-ПГУ-ын нийтлэг шошголох аргууд:
| арга | давуу тал | дутагдал | хэрэглээний хамрах хүрээ |
| SYBR GreenⅠ | Өргөн хэрэглээний, мэдрэмжтэй, хямд, тохиромжтой | Праймерын шаардлага өндөр, өвөрмөц бус туузанд өртөмтгий байдаг | Энэ нь төрөл бүрийн зорилтот генийн тоон шинжилгээ, генийн илэрхийллийн судалгаа, трансген рекомбинант амьтан, ургамлын судалгаанд тохиромжтой. |
| TaqMan | Сайн өвөрмөц байдал, давтагдах чадвар өндөр | Үнэ нь өндөр бөгөөд зөвхөн тодорхой зорилгод тохиромжтой. | Эмгэг төрүүлэгчийг илрүүлэх, эмэнд тэсвэртэй генийн судалгаа, эмийн үр нөлөөг үнэлэх, удамшлын өвчний оношлогоо. |
| молекулын гэрэлт цамхаг | Өндөр өвөрмөц байдал, флюресцент, бага дэвсгэр | Үнэ нь өндөр, зөвхөн тодорхой зорилгод тохирсон, хийц нь хэцүү, үнэ нь өндөр. | Тусгай генийн шинжилгээ, SNP шинжилгээ |
2. Туршилтын үе шатууд
2.1 Туршилтын бүлгийн тухай- бүлэгт олон тооны худаг байх ёстой бөгөөд биологийн давталт байх ёстой.
| ① | Хоосон хяналт | Туршилтанд эсийн өсөлтийн төлөвийг илрүүлэхэд ашигладаг |
| ② | Сөрөг хяналтын siRNA (өвөрмөц бус siRNA дараалал) | RNAi-ийн үйл ажиллагааны өвөрмөц байдлыг харуулах.siRNA нь 200нМ-ийн концентрацид өвөрмөц бус стрессийн хариу урвалыг өдөөж болно. |
| ③ | Transfection Reagent Control | Трансфекцийн урвалжийн эсэд үзүүлэх хоруу чанар эсвэл зорилтот генийн илэрхийлэлд үзүүлэх нөлөөг хасах |
| ④ | Зорилтот генийн эсрэг siRNA | Зорилтот генийн илэрхийлэлийг нураа |
| ⑤ (заавал биш) | эерэг siRNA | Туршилтын систем болон үйл ажиллагааны асуудлыг шийдвэрлэхэд ашигладаг |
| ⑥ (заавал биш) | Флюресцент хяналтын siRNA | Эсийн дамжуулалтын үр ашгийг микроскопоор ажиглаж болно |
2.2 Праймерын дизайны зарчим
| Олшруулсан фрагментийн хэмжээ | 100-150 битийн хурдтай байх нь дээр |
| Праймерын урт | 18-25б |
| GC контент | 30%-70%, болж өгвөл 45%-55% |
| Tm утга | 58-60℃ |
| Дараалал | T/C тасралтгүй байхаас зайлсхийх;A/G тасралтгүй |
| 3 төгсгөлийн дараалал | GC rich эсвэл AT rich-ээс зайлсхийх;терминалын суурь нь G эсвэл C байвал тохиромжтой;Т-ээс зайлсхийх нь дээр |
| Нэмэлт байдал | Праймер дотор эсвэл хоёр праймерын хооронд 3-аас дээш суурийн нэмэлт дарааллаас зайлсхий |
| Онцлог байдал | Праймерын өвөрмөц байдлыг баталгаажуулахын тулд тэсэлгээний хайлтыг ашиглана уу |
①SiRNA нь төрөл зүйлийн өвөрмөц бөгөөд төрөл бүрийн зүйлийн дараалал өөр өөр байх болно.
②SiRNA нь хөлдөөж хатаасан нунтаг хэлбэрээр савлагдсан бөгөөд тасалгааны температурт 2-4 долоо хоног тогтвортой хадгална.
2.3 Урьдчилан бэлтгэх шаардлагатай багаж хэрэгсэл, урвалж
| Праймер (дотоод лавлагаа) | Урагш болон урвуу хоёрыг оруулаад |
| Праймерууд (зорилтот ген) | Урагш болон урвуу хоёрыг оруулаад |
| Зорилтот Si РНХ (3 тууз) | Ерөнхийдөө компани нь 3 туузыг нэгтгэж, дараа нь RT-PCR-ээр гурвын аль нэгийг нь сонгоно. |
| Шилжүүлэн суулгах хэрэгсэл | Lipo2000 гэх мэт. |
| РНХ хурдан олборлох хэрэгсэл | Трансфекци хийсний дараа РНХ-ийн олборлолтод зориулагдсан |
| Хурдан урвуу транскрипцийн багц | cDNA синтезийн хувьд |
| ПГУ-ын олшруулах хэрэгсэл | 2×Super SYBR Green qPCR мастер холимог |
2.4 Туршилтын тодорхой үе шатанд анхаарах асуудлуудын тухайд:
①siRNA дамжуулалтын процесс
1. Бүрэхийн тулд та 24 худагтай хавтан, 12 худагтай хавтан эсвэл 6 худагтай хавтанг сонгож болно (24 худагтай хавтангийн худаг бүрт санал болгож буй РНХ-ийн дундаж концентраци нь ойролцоогоор 100-300 нг/uL), эсийн трансфекцийн оновчтой нягтрал нь 60-80% хүртэл байна.
2. Шилжүүлэн суулгах үе шатууд болон тусгай шаардлагууд нь зааврын дагуу хатуу явагдана.
3. Шилжүүлсний дараа mRNA илрүүлэх (RT-PCR) эсвэл 48-96 цагийн дотор уураг илрүүлэхийн тулд дээжийг 24-72 цагийн дотор цуглуулж болно (WB)
② РНХ олборлох үйл явц
1. Экзоген ферментээр бохирдохоос сэргийлнэ.Үүнд голчлон маск, бээлий өмсөхийг хатуу тусгасан;ариутгасан пипеткийн үзүүр ба EP хоолойг ашиглах;туршилтанд ашигласан ус нь RNase-гүй байх ёстой.
2. Хурдан олборлох хэрэгсэлд санал болгосны дагуу хоёр дахин хийхийг зөвлөж байна, энэ нь цэвэршилт, гарцыг үнэхээр сайжруулах болно.
3. Хаягдал шингэн нь РНХ-ийн баганад хүрч болохгүй.
③ РНХ-ийн хэмжигдэхүүн
РНХ-г гарган авсны дараа шууд Nanodrop-оор хэмжигдэх боломжтой бөгөөд хамгийн бага уншилт нь 10 нг/ул хүртэл бага байж болно.
④Урвуу транскрипцийн процесс
1. RT-qPCR-ийн мэдрэг чанар өндөр учир дээж тус бүрд 3-аас доошгүй зэрэгцээ цооног гаргаж, дараагийн Ct нь хэт өөр байх эсвэл SD нь статистикийн шинжилгээнд хэт том байхаас сэргийлнэ.
2. Мастер хольцыг дахин дахин хөлдөөж, гэсгээж болохгүй.
3. Хоолой/нүх бүрийг шинэ үзүүрээр солих ёстой!Дээж нэмэхийн тулд ижил пипеткийн үзүүрийг байнга бүү ашигла!
4. Дээжийг нэмсний дараа 96 цооногийн хавтан дээр наасан хальсыг хавтангаар тэгшлэх шаардлагатай.Хоолойн хананд байгаа шингэн нь доошоо урсаж, агаарын бөмбөлгийг арилгахын тулд машин дээр тавихын өмнө центрифуг хийх нь хамгийн сайн арга юм.
⑤ Нийтлэг муруй шинжилгээ
| Логарифмын өсөлтийн үе байхгүй | Загварын өндөр концентраци байж магадгүй |
| CT утга байхгүй | Флюресцент дохиог илрүүлэх алдаатай алхамууд; праймер эсвэл датчикийн доройтол - түүний бүрэн бүтэн байдлыг PAGE электрофорезоор илрүүлж болно; загвар хангалтгүй хэмжээ; загваруудын доройтол - дээж бэлтгэх явцад хольц оруулахгүй, олон удаа хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх; |
| Ct>38 | Олшруулах үр ашиг бага;ПГУ-ын бүтээгдэхүүн хэт урт;янз бүрийн урвалын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг доройтуулдаг |
| Шугаман олшруулалтын муруй | Дахин давтагдах хөлдөөх, гэсгээх цикл эсвэл гэрэлд удаан хугацаагаар өртөх үед датчикууд хэсэгчлэн эвдэрч болзошгүй. |
| Давхардсан нүхний ялгаа нь ялангуяа том байна | Урвалын уусмал бүрэн хайлаагүй эсвэл урвалын уусмал холигдоогүй;ПГУ-ын багажны дулааны банн нь флюресцент бодисоор бохирдсон |
2.5 Өгөгдлийн шинжилгээний тухай
qPCR-ийн өгөгдлийн шинжилгээг харьцангуй хэмжигдэхүүн ба үнэмлэхүй хэмжигдэхүүн гэж хувааж болно.Жишээлбэл, эмчилгээний бүлгийн эсүүд нь хяналтын бүлгийн эсүүдтэй харьцуулахад,
X генийн мРНХ хэдэн удаа өөрчлөгдөж байгаа нь харьцангуй тоон үзүүлэлт юм;тодорхой тооны эсүүдэд X генийн мРНХ
Хэдэн хувь байгаа бол энэ нь үнэмлэхүй тоон үзүүлэлт юм.Лабораторид бидний хамгийн их ашигладаг зүйл бол харьцангуй тоон арга юм.Ихэвчлэн,2-ΔΔct аргань туршилтанд хамгийн их ашиглагддаг тул зөвхөн энэ аргыг энд дэлгэрэнгүй танилцуулах болно.
2-ΔΔct арга: Хүлээн авсан үр дүн нь хяналтын бүлгийн зорилтот гентэй харьцуулахад туршилтын бүлгийн зорилтот генийн илэрхийллийн зөрүү юм.Зорилтот ген ба дотоод лавлагаа генийн олшруулалтын үр ашиг нь 100% -тай ойролцоо байх ёстой бөгөөд харьцангуй хазайлт нь 5% -иас хэтрэхгүй байх ёстой.
Тооцооллын арга нь дараах байдалтай байна.
Δct хяналтын бүлэг = хяналтын бүлгийн зорилтот генийн ct утга – хяналтын бүлгийн дотоод лавлагааны генийн ct утга
Δct туршилтын бүлэг = туршилтын бүлгийн зорилтот генийн ct утга – туршилтын бүлгийн дотоод лавлагааны генийн ct утга
ΔΔct=Δct туршилтын бүлэг-Δct хяналтын бүлэг
Эцэст нь илэрхийллийн түвшний зөрүүний үржвэрийг тооцоол.
Fold=2-ΔΔct-ийг өөрчлөх (excel функцэд POWER тохирох)
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
Шуудангийн цаг: 2023 оны 5-р сарын 20-ны хооронд
