Уламжлалт урвуу транскриптаз нь өндөр температурыг тэсвэрлэдэггүй (MMLV-ийн үйл ажиллагааны оновчтой температур нь 37-50 ° C, AMV нь 42-60 ° C байна).Илүү нарийн төвөгтэй вирусын РНХ-ийг бага температурт сДНХ руу үр дүнтэйгээр урвуу буулгах боломжгүй тул илрүүлэх үр ашиг буурна.Уламжлалт RT-qPCR нь ерөнхийдөө хоёр гол ферментийн (урвуу транскриптаза ба ДНХ полимераза) оролцоог шаарддаг бөгөөд энэ нь урвалын системийн ажиллагааг хялбарчилж, зардлыг бууруулах боломжгүй болгодог.Энд бид TtH болон RevTaq хэмээх өндөр температурт тэсвэртэй хоёр урвуу транскриптазыг танилцуулах болно.Эдгээр хоёр фермент нь ДНХ полимеразын үүргийг гүйцэтгэдэг тул тэдгээрийг хоёр функциональ фермент гэж нэрлэдэг.

TtH ДНХ полимераз

Thermus thermophilus HB8 термофиль бактериас гаралтай TtH-ийн талаар та сонссон байх.Mg2+ зэрэг хоёр валент катионууд байгаа тохиолдолд ДНХ полимеразын идэвхжилтэй байдаг.Энэ нь Taq enzyme гэх мэт ПГУ-ын урвалд өргөн хэрэглэгддэг боловч Taq ферментээс илүү өндөр дулаан тэсвэрлэх чадвартай тул өндөр GC агууламж бүхий ПГУ-д илүү сайн нөлөө үзүүлдэг.

· Энэ фермент нь үндсэндээ 3′→5′ экзонуклеазын идэвхжилгүй ба 5′→3′ экзонуклеазын идэвхжилгүй тул дидеокси дараалал тогтооход мөн ашиглаж болно.

· Энэ фермент нь RTase идэвхжилтэй.Mn2+ байгаа тохиолдолд RTase идэвхжил нэмэгдэнэ.Энэ функцийг ашиглан урвуу транскрипцийн урвал болон ПГУ-ын урвалыг нэг хоолойд, өөрөөр хэлбэл нэг шатлалт RT-PCR хийхэд ашиглаж болно.Гэсэн хэдий ч Mn2+ байгаа тохиолдолд RT-PCR-ийн нарийвчлал өндөр биш юм.RT үйл ажиллагаа нь rnaase H үйл ажиллагаатай ямар ч холбоогүй юм.

· Tth-ДНХ полимеразын идэвхжил (pH9, оновчтой +55℃～+70℃, хамгийн ихдээ +95℃) нэмэгдсэн нь РНХ-ийн хоёрдогч бүтцээс үүдэлтэй асуудлуудыг даван туулдаг.Үүссэн cDNA-г Mg2+ ионуудын дэргэд ижил ферменттэй ПГУ-аар олшруулж болно.

· Tth-ДНХ полимераза нь өндөр температурт урвуу транскрипц хийх, ДНХ олшрох чадвар нь энэхүү ферментийг эсийн болон вирусын РНХ-ийн тоон RT-ПГУ, клончлох, генийн экспрессийн шинжилгээнд тустай болгодог.
· Тт-ДНХ полимеразыг RT-ПГУ-д РНХ-ийг 1кб хүртэл өсгөхөд ашигладаг.

Онцлог, давуу тал

Т-р ДНХ полимераз:

• Полимеразын гинжин урвалын (ПГУ) бүтээгдэхүүний хэмжээ, RT-ПГУ-ын урвалд дор хаяж 1000 bp байх ёстой.

• Өөрчлөгдсөн дезоксирибонуклеозид трифосфатыг субстрат болгон хүлээн авна

• RNase H-ийн идэвхжилтэй холбоогүй

• Ихэвчлэн РНХ-д агуулагдах хоёрдогч бүтэц өндөртэй холбоотой асуудлуудыг даван туулах дулааны өндөр тогтвортой байдалтай байдаг

RevTaq RT-ПГУ-ын ДНХ полимераз

Урвуу транскриптазын идэвхжилтэй халуунд тэсвэртэй ДНХ полимераз

RevTaq-RT-PCR-ДНХ полимераз нь чиглэсэн болон зохиомол хувьслын үр дүнд олж авсан урвуу транскриптаза ба ДНХ полимераза үйл ажиллагаа бүхий инженерчлэгдсэн, өндөр халуунд тэсвэртэй, хос функцтэй фермент юм.

· 95°C температурт RevTaq RT-ПГУ-ын ДНХ полимеразагийн хагас задралын хугацаа 40 минутаас их байна.

· RevTaq RT-PCR ДНХ полимераза нь РНХ-ийн загвараас шууд өндөр температурт урвуу транскрипц хийх боломжийг олгодог ба урвуу транскрипцийн алхамыг олон удаа давтаж, илүү олон cDNA загвар үүсгэх боломжтой.

· RevTaq RT-PCR ДНХ полимераза нь “тэг шаттай” RT-PCR (изотерм урвуу транскрипцийн алхам байхгүй) боломжийг олгодог, учир нь циклийн ПГУ-ын өргөтгөлийн шатанд урвуу транскрипц болон ДНХ-ийн олшруулалт нэгэн зэрэг явагддаг.Энэ нь мөн өндөр температурт урвуу транскрипцийн урвалыг дэмжиж, улмаар өндөр температурт РНХ-ийн хүчтэй хоёрдогч бүтцийг хайлахад тулгардаг бэрхшээлийг багасгадаг.

· Аптамер дээр суурилсан халуун эхлүүлэх томъёоны улмаас RevTaq RT-ПГУ-ын ДНХ полимераз нь 57°С-аас дээш температурт бэхлэх, сунгах үед илүү сайн үр дүн өгнө.

· Фермент нь халуунд тэсвэртэй тул маш өндөр хайлах цэг (>60°C) бүхий праймер болон датчикийг зохион бүтээхийг зөвлөж байна.

· Урвалын тохируулга хийх явцад температурын градиентаар дамжих/өргөтгөх үе шатны температурыг оновчтой болгохыг зөвлөж байна.

· Температур өндөр байх тусам ПГУ-ын өвөрмөц чанар өндөр болно.Урвуу транскрипцийн мөчлөг нь ихэвчлэн ПГУ-ын циклээс өндөр температурт явагддаг, учир нь ДНХ праймер:РНХ загвар эрлийзжих нь ихэвчлэн ДНХ праймер:cDNA загвар дуплексээс илүү хайлах цэгтэй байдаг.

· RevTaq RT-ПГУ-ын ДНХ полимераза нь генийн инженерчлэгдсэн, оновчтой, ампликоны хэмжээ 60-300 bp хооронд байна.

RevTaq RT-ПГУ-ын ДНХ полимераз илрүүлэх хязгаар 4 хувь хүрнэ/

Оновчтой урвалын системийг (өндөр хайлах цэгийн праймерыг бий болгох) зурагт үзүүлэв.RevTaq RT-PCR ДНХ полимеразаар удирдуулсан RT-PCR нь TaqPath 1-шатлалт RT-qPCR мастер хольцоос илүү мэдрэмжтэй, сорьцын шингэрүүлэлтийн градиент бага илрүүлдэг.

Илүү давуу талууд:

Түргэн эхлүүлэх функц → Дулааны денатурацийн эхний алхамыг алгасаж болно.

Халуун эхлэх аптамер томъёо → 100% ферментийн идэвхийг нэн даруй хангаж, бага температурт (<57 ° C) өвөрмөц бус олшролтоос сэргийлнэ.

RevTaq RT-ПГУ-ын ДНХ полимераз нь түүхий урвалын дээжийг боловсруулах чадвартай тул РНХ-ийн задлах алхамыг орхигдуулсан.Энэ нь эукариот, бактери, вирусын эсийн мембраныг халуун RT-ПГУ-ын мөчлөгт нэн даруй устгаж чаддаг.

IVD түүхий эдийн түвшин → чанарын өндөр стандарт, туйлын өрсөлдөхүйц үнэ