• ПГУ нь бага хэмжээний ДНХ-ийн загвараас ДНХ-ийг олшруулахад ашигладаг арга юм.RT-ПГУ нь урвуу транскрипцийг ашиглан РНХ-ийн эх үүсвэрээс ДНХ-ийн загвар гаргаж, дараа нь олшруулж болно.
• ПГУ ба RT-ПГУ нь ихэвчлэн эцсийн цэгийн урвал байдаг бол qPCR болон RT-qPCR нь ПГУ-ын урвалын явцад байгаа бүтээгдэхүүний нийлэгжилтийн хурдны кинетикийг ашиглан одоогийн байгаа загварын хэмжээг тодорхойлдог.
• Дижитал ПГУ гэх мэт шинэ аргууд нь ДНХ-ийн анхны загварыг үнэмлэхүй тоогоор тодорхойлох боломжийг олгодог бол изотерм ПГУ гэх мэт аргууд нь найдвартай үр дүнд хүрэхийн тулд үнэтэй тоног төхөөрөмжийн хэрэгцээг бууруулдаг.

Полимеразын гинжин урвал (ПГУ) нь ДНХ, РНХ-ийн дарааллыг олшруулах, илрүүлэхэд зориулагдсан харьцангуй энгийн бөгөөд өргөн хэрэглэгддэг молекул биологийн арга юм.Олон хоног үргэлжилдэг ДНХ-ийг клонжуулах, олшруулах уламжлалт аргуудтай харьцуулахад ПГУ-д хэдхэн цаг л шаардлагатай байдаг.ПГУ нь маш мэдрэмтгий бөгөөд тодорхой дарааллыг илрүүлэх, өсгөхөд хамгийн бага загвар шаарддаг.ПГУ-ын үндсэн аргууд нь энгийн ДНХ, РНХ илрүүлэхээс илүү дэвшилтэт болсон.Доор бид ПГУ-ын янз бүрийн аргууд болон Enzo Life Sciences-аас таны судалгааны хэрэгцээнд зориулж өгдөг урвалжуудын тоймыг өгсөн болно.Бид эрдэмтдэд дараагийн судалгааны төсөлдөө ашиглах ПГУ-ын урвалжуудыг түргэн шуурхай авахад нь туслахыг зорьж байна!

ПГУ

Стандарт ПГУ-ын хувьд танд зөвхөн ДНХ полимераз, магни, нуклеотид, праймер, олшруулах ДНХ-ийн загвар, термоцикл л хэрэгтэй.ПГУ-ын механизм нь зорилгынхоо хэрээр энгийн: 1) давхар судалтай ДНХ (dsDNA) нь дулаанаар денатуратлагдсан, 2) праймерууд нь ДНХ-ийн нэг хэлхээтэй нийлдэг, 3) праймерууд нь ДНХ-ийн полимеразын нөлөөгөөр сунгагддаг бөгөөд үүний үр дүнд ДНХ-ийн хоёр хуулбар үүсдэг. анхны ДНХ хэлхээ.Хэд хэдэн температур, цаг хугацааны туршид денатураци, анивчих, сунгах процессыг олшруулалтын нэг мөчлөг гэж нэрлэдэг (Зураг 1).

Циклийн алхам бүрийг ашигласан загвар болон праймерын багцад оновчтой болгох хэрэгтэй.Энэ мөчлөг нь ойролцоогоор 20-40 удаа давтагддаг бөгөөд дараа нь олшруулсан бүтээгдэхүүнийг ихэвчлэн агароз гелээр шинжилж болно (Зураг 2).

ПГУ нь маш мэдрэмтгий арга бөгөөд нэг урвалын хувьд маш бага хэмжээ шаардагддаг тул хэд хэдэн урвалын үндсэн хольц бэлтгэхийг зөвлөж байна.Мастер хольцыг сайтар хольж, дараа нь урвалын тоогоор хувааж, урвал бүр ижил хэмжээний фермент, dNTP, праймер агуулсан байх ёстой.Enzo Life Sciences зэрэг олон нийлүүлэгчид праймер болон ДНХ-ийн загвараас бусад бүх зүйлийг агуулсан ПГУ-ын хольцыг санал болгодог.

Гуанин/цитозиноор баялаг (GC-аар баялаг) бүсүүд нь стандарт ПГУ-ын арга техникт сорилт болдог.GC-ээр баялаг дараалал нь бага GC агуулгатай дарааллаас илүү тогтвортой байдаг.Цаашилбал, GC-ээр баялаг дараалал нь үсний хавчаар гогцоо гэх мэт хоёрдогч бүтцийг бий болгох хандлагатай байдаг.Үүний үр дүнд GC-ээр баялаг давхар судал нь денатурацийн үе шатанд бүрэн салгахад хэцүү байдаг.Тиймээс ДНХ полимераз нь шинэ хэлхээг ямар ч саадгүйгээр нэгтгэж чадахгүй.Илүү өндөр денатурацийн температур нь үүнийг сайжруулж, илүү өндөр температурт тохируулж, зөөлрүүлэх хугацааг богиносгох нь GC-ээр баялаг праймерыг тодорхой бус холбохоос сэргийлж чадна.Нэмэлт урвалжууд нь GC-ээр баялаг дарааллын олшруулалтыг сайжруулж чадна.DMSO, глицерин, бетаин нь GC-ийн харилцан үйлчлэлийн улмаас үүссэн хоёрдогч бүтцийг тасалдуулахад тусалдаг бөгөөд ингэснээр давхар хэлхээг салгахад тусалдаг.

Халуун эхлэл ПГУ

Тодорхой бус олшруулалт нь ПГУ-ын үед тохиолдож болох асуудал юм.ПГУ-д ашигладаг ихэнх ДНХ полимеразууд 68-72 хэмийн температурт хамгийн сайн ажилладаг.Гэсэн хэдий ч фермент нь бага температурт идэвхтэй байж болно, гэхдээ бага зэрэг.Хагалгааны температураас хамаагүй доогуур температурт праймерууд нь өвөрмөц бус байдлаар холбогдож, урвалыг мөсөн дээр суулгасан ч өвөрмөц бус олшроход хүргэдэг.Тодорхой температурт хүрсний дараа л ДНХ полимеразаас салдаг полимеразын дарангуйлагчийг ашиглах замаар үүнийг урьдчилан сэргийлэх боломжтой, иймээс халуун эхлэх ПГУ гэж нэрлэдэг.Дарангуйлагч нь полимеразыг холбож, денатурацийн анхны температурт (ихэвчлэн 95 ° C) денатурат үүсгэдэг эсрэгбие байж болно.

Өндөр үнэнч полимераз

ДНХ-ийн полимеразууд анхны загвар дарааллаар нэлээд нарийвчлалтай олшрох боловч нуклеотидын тааруулахад алдаа гарч болно.Клончлох гэх мэт программуудын таарамжгүй байдал нь хуулбарыг тайрч, буруу орчуулсан эсвэл идэвхгүй уураг үүсгэдэг.Эдгээр үл нийцэх байдлаас зайлсхийхийн тулд "засвар унших" үйл ажиллагаа бүхий полимеразуудыг тодорхойлж, ажлын урсгалд оруулсан болно.Анхны засварлах полимераз Pfu нь 1991 онд Pyrococcus furiosus-д илэрсэн.Энэхүү Pfu фермент нь 3'-5' экзонуклеазын идэвхжилтэй.ДНХ олшрох тусам экзонуклеаз нь хэлхээний 3' төгсгөлд таарахгүй нуклеотидыг зайлуулдаг.Дараа нь зөв нуклеотид солигдож, ДНХ-ийн синтез үргэлжилж байна.Буруу нуклеотидын дарааллыг тодорхойлох нь зөв нуклеозид трифосфатыг ферменттэй холбоход тулгуурладаг бөгөөд үр ашиггүй холболт нь синтезийг удаашруулж, зөв ​​солих боломжийг олгодог.Pfu полимеразын шалгах үйл ажиллагаа нь Так ДНХ полимеразатай харьцуулахад эцсийн дараалалд бага алдаа гаргадаг.Сүүлийн жилүүдэд бусад proofreading ферментүүдийг илрүүлж, анхны Pfu ферментийн өөрчлөлтийг ДНХ-ийн олшруулалтын явцад алдааны түвшинг бууруулах зорилгоор хийсэн.

RT-ПГУ

Урвуу транскрипцийн ПГУ буюу RT-PCR нь РНХ-ийг загвар болгон ашиглах боломжийг олгодог.Нэмэлт алхам нь РНХ-ийг илрүүлэх, өсгөх боломжийг олгодог.РНХ нь урвуу транскриптаза ашиглан нэмэлт ДНХ (cDNA) руу урвуу хөрвүүлэгддэг.РНХ-ийн загварын чанар, цэвэр байдал нь RT-ПГУ-ын амжилтанд зайлшгүй шаардлагатай.RT-ПГУ-ын эхний алхам бол ДНХ/РНХ-ийн эрлийз нийлэгжилт юм.Урвуу транскриптаза нь мөн RNase H функцтэй бөгөөд энэ нь эрлийз RNA хэсгийг задалдаг.Дараа нь нэг хэлхээтэй ДНХ молекул нь урвуу транскриптазын ДНХ-ээс хамааралтай ДНХ полимеразын идэвхжилээр cDNA-д орж дуусдаг.Эхний хэлхээний урвалын үр ашиг нь олшруулах үйл явцад нөлөөлж болно.Эндээс эхлэн cDNA-г олшруулахын тулд стандарт ПГУ-ын процедурыг ашигладаг.RT-ПГУ-ын тусламжтайгаар РНХ-ийг cDNA болгон хувиргах боломж нь олон давуу талтай бөгөөд үүнийг голчлон генийн экспрессийн шинжилгээнд ашигладаг.РНХ нь нэг судалтай бөгөөд маш тогтворгүй тул түүнтэй ажиллахад хэцүү болгодог.Энэ нь биологийн дээжинд РНХ-ийн транскриптийг тодорхойлох qPCR-ийн эхний алхам болдог.

qPCR ба RT-qPCR

Тоон ПГУ (qPCR) нь олон төрлийн хэрэглээнд нуклейн хүчлийг илрүүлэх, тодорхойлох, хэмжихэд ашиглагддаг.RT-qPCR-д РНХ-ийн транскриптийг дээр дурдсанчлан эхлээд cDNA руу урвуу хуулбарлах замаар тоон үзүүлэлтийг тодорхойлдог бөгөөд дараа нь qPCR-ийг хийдэг.Стандарт ПГУ-ын нэгэн адил ДНХ-ийг денатураци, анялах, сунгах гэсэн гурван үе шаттайгаар олшруулдаг.Гэсэн хэдий ч qPCR-д флюресцент шошго нь ПГУ-ын явцын дагуу мэдээлэл цуглуулах боломжийг олгодог.Энэ техник нь олон төрлийн арга, химийн найрлагатай тул олон давуу талтай.

Будагт суурилсан qPCR-д (ихэвчлэн ногоон) флюресцент тэмдэглэгээ нь dsDNA холбогч будгийг ашиглан олшруулсан ДНХ молекулын хэмжээг тодорхойлох боломжийг олгодог.Цикл бүрийн үед флюресценцийг хэмждэг.Флюресценцийн дохио нь хуулбарласан ДНХ-ийн хэмжээтэй пропорциональ хэмжээгээр нэмэгддэг.Иймээс ДНХ-ийг “бодит цаг хугацаанд” хэмждэг (Зураг 3).Будагт суурилсан qPCR-ийн сул тал нь нэг удаад зөвхөн нэг объектыг шалгах боломжтой бөгөөд будаг нь дээжинд байгаа аливаа ds-DNA-тай холбогддог.

Зорилтотод суурилсан qPCR-д дээж бүрээс олон зорилтот объектыг нэгэн зэрэг илрүүлж болох боловч энэ нь праймераас гадна зорилтот датчикийг оновчтой болгох, дизайн хийх шаардлагатай.Хэд хэдэн төрлийн датчикийн загвар байдаг боловч хамгийн түгээмэл төрөл нь флюорофор болон унтраагчийг агуулсан гидролизийн датчик юм.Флюресценцийн резонансын энергийн дамжуулалт (FRET) нь датчик бүрэн бүтэн байх үед унтраагчаар дамжуулан флюрофор ялгарахаас сэргийлдэг.Гэсэн хэдий ч ПГУ-ын урвалын үед датчик нь праймерын өргөтгөл болон холбогдох тодорхой дарааллыг олшруулах явцад гидролизд ордог.Сорьцын хуваагдал нь флюрофорыг унтраагчаас салгаж, флюресценцийг олшруулахаас хамааралтай өсгөхөд хүргэдэг (Зураг 4).Тиймээс датчик дээр суурилсан qPCR урвалын флюресценцийн дохио нь дээжинд байгаа датчикийн зорилтот дарааллын хэмжээтэй пропорциональ байна.Пробед суурилсан qPCR нь будагч бодист суурилсан qPCR-ээс илүү өвөрмөц байдаг тул энэ нь ихэвчлэн qPCR-д суурилсан оношлогооны шинжилгээнд ашиглагддаг технологи юм.

Изотермийн олшруулалт

Дээр дурьдсан ПГУ-ын техник нь денатураци, зөөлрүүлэх, сунгах үе шатуудад камерын температурыг зөв өсгөх, доошлуулахын тулд үнэтэй термоциклийн төхөөрөмж шаарддаг.Ийм нарийн төхөөрөмж шаарддаггүй хэд хэдэн техникийг боловсруулсан бөгөөд энгийн усан ваннд эсвэл сонирхлын эсийн дотор ч хийж болно.Эдгээр аргуудыг хамтдаа изотермийн олшруулалт гэж нэрлэдэг бөгөөд экспоненциал, шугаман эсвэл каскадын олшруулалт дээр суурилдаг.

Изотермийн олшруулалтын хамгийн алдартай төрөл бол гогцоонд зуучлагдсан изотерм олшруулалт буюу LAMP юм.LAMP загвар ДНХ эсвэл РНХ-ийг олшруулахын тулд 65⁰C-т экспоненциал олшруулалтыг ашигладаг.LAMP-ийг гүйцэтгэхдээ зорилтот ДНХ-ийн бүс нутгийг нөхдөг дөрвөөс зургаан праймерыг ДНХ полимеразатай хамт шинэ ДНХ-ийг нийлэгжүүлэхэд ашигладаг.Эдгээр праймеруудын хоёр нь бусад праймеруудын дарааллыг таньж, тэдгээрийг холбодог нэмэлт дараалалтай бөгөөд шинээр нийлэгжсэн ДНХ-д "гогцоо" бүтцийг бий болгож, дараа нь олшруулалтын дараагийн шатанд праймерыг нөхөхөд тусалдаг.LAMP-ийг флюресцент, агароз гель электрофорез эсвэл колориметр зэрэг олон аргаар дүрсэлж болно.Өнгө хэмжигчээр бүтээгдэхүүн байгаа эсэх, байхгүй эсэхийг нүдээр харах, илрүүлэхэд хялбар, шаардлагатай үнэтэй тоног төхөөрөмж байхгүй зэрэг нь LAMP-ийг эмнэлзүйн лабораторийн шинжилгээ хийх боломжгүй газруудад SARS-CoV-2 шинжилгээ хийх, дээж хадгалах, тээвэрлэхэд тохиромжтой сонголт болгосон. боломжгүй байсан эсвэл өмнө нь ПГУ-ын термоциклийн төхөөрөмжгүй лабораторид.