Праймер дизайны үндэс (99% асуудлыг шийдэж болно)
1. Праймерын урт: Сурах бичигт 15-30bp, ихэвчлэн ойролцоогоор 20bp шаардлагатай.Бодит нөхцөл нь өвөрмөц байдлыг хангахын тулд 18-24bp байх нь илүү дээр юм, гэхдээ илүү сайн, хэт урт праймер нь мөн өвөрмөц чанарыг бууруулж, ургацыг бууруулдаг.
2. Праймерын олшруулах хугацаа: 200-500bp тохиромжтой бөгөөд тодорхой нөхцөлд фрагментийг 10кб хүртэл өргөжүүлж болно.
3. Праймер суурь: G+C-ийн агууламж 40-60% байх ёстой, хэт бага G+C өсгөвөрлөх нөлөө сайн биш, хэт их G+C нь өвөрмөц бус зурвас гарч ирэхэд хялбар байдаг.ATGC нь 5-аас дээш пурин эсвэл пиримидин нуклеотидын бөөгнөрөлөөс зайлсхийж, санамсаргүй байдлаар хамгийн сайн тархдаг.Тогтвортой байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд 5′-ийн төгсгөл ба завсрын дараалалд зориулсан олон gc, 3′-ийн төгсгөлд баялаг GC-ээс зайлсхий, сүүлийн 3 суурийн хувьд GC байхгүй, эсвэл сүүлийн 5 суурийн 3-д GC байхгүй.
4. Праймер дахь хоёрдогч бүтцээс зайлсхийж, хоёр праймерын хооронд, ялангуяа 3 'төгсгөлд комплемент үүсэхээс зайлсхийх хэрэгтэй, эс тэгвээс праймер димер үүсч, өвөрмөц бус олшруулсан тууз үүснэ.
5. Праймерын 3 'төгсгөлд байрлах суурь, ялангуяа сүүлчийн болон эцсийн өмнөх сууриуд нь хослогдоогүй терминал суурийн улмаас ПГУ-ын алдаа гарахаас зайлсхийхийн тулд хатуу хосолсон байх ёстой.
6. Праймерууд нь тохирох хуваагдлын хэсгүүдтэй эсвэл нэмж болно, олшруулсан зорилтот дараалал нь зохих хуваагдлын хэсгүүдтэй байх нь зүйтэй бөгөөд энэ нь хуваагдлын шинжилгээ эсвэл молекулын клончлолд маш ашигтай байдаг.
7. Праймеруудын онцлог: праймерууд нь нуклейн хүчлийн дарааллын мэдээллийн сан дахь бусад дараалалтай тодорхой ижил төстэй байх ёсгүй.
8. Програм хангамжийг ашиглаж сур: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Энэ онлайн загвар нь хамгийн сайн ажилладаг).
Дээрх агуулга нь праймерын дизайны асуудлыг дор хаяж 99% -ийг шийдэж чадна.
Праймер дизайны нарийн ширийн зүйлийг хянах
1. Праймерын урт
Ерөнхий праймерын урт нь 18-30 суурь юм.Ерөнхийдөө праймерын температурыг тодорхойлох хамгийн чухал хүчин зүйл бол праймерын урт юм.Праймерыг зөөлрүүлэх температурыг ерөнхийд нь сонгодог (Tm утга -5℃), зарим нь Tm утгыг шууд ашигладаг.Дараах томьёог ашиглан праймерыг зөөлрүүлэх температурыг ойролцоогоор тооцоолж болно.
Праймерын урт 20bp-ээс бага үед: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Праймерын урт нь 20bp-ээс их байвал: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/урт-5℃
Нэмж дурдахад, олон програм хангамжийг халах температурыг тооцоолоход ашиглаж болно, тооцоолох зарчим нь өөр байх тул заримдаа тооцоолсон утга нь бага зайтай байж болно.ПГУ-ын урвалыг оновчтой болгохын тулд хамгийн сайн үр ашиг, өвөрмөц байдлыг хангахын тулд 54 ° C-аас багагүй температурыг хангадаг хамгийн богино праймеруудыг ашигладаг.
Ерөнхийдөө праймерын өвөрмөц байдал нь нэмэлт нуклеотид бүрт дөрөв дахин нэмэгддэг тул ихэнх хэрэглээний праймерын хамгийн бага урт нь 18 нуклеотид байдаг.Праймерын уртын дээд хязгаар нь маш чухал биш бөгөөд голчлон урвалын үр дүнтэй холбоотой байдаг.Энтропийн улмаас праймер урт байх тусам зорилтот ДНХ-тэй холбогдож, ДНХ полимеразыг холбох тогтвортой давхар судалтай загвар үүсгэдэг.
Праймерыг зохион бүтээхэд программ хангамжийг ашиглахдаа праймерын уртыг TM утгаараа ээлжлэн тодорхойлж болно, ялангуяа флюресценцийн тоон ПГУ-ын праймеруудын хувьд TM=60℃ ба түүнээс дээш температурыг хянах шаардлагатай.
2.GC контент
Ерөнхийдөө праймерын дараалал дахь G+C-ийн агууламж 40% ~ 60% байх ба хос праймерын GC агууламж ба Tm утгыг уялдуулах хэрэгтэй.Хэрэв праймер нь GC эсвэл AT ноцтой хандлагатай бол праймерын 5' төгсгөлд тохирох хэмжээний A, T эсвэл G, C сүүлийг нэмж болно.
3. Хагалах температур
Бэлтгэх температур нь гинжнээс гарах температураас 5℃ бага байх ёстой.Хэрэв праймерын суурийн тоо бага бол нөхөх температурыг зохих ёсоор нэмэгдүүлэх боломжтой бөгөөд энэ нь ПГУ-ын өвөрмөц чанарыг нэмэгдүүлдэг.Хэрэв суурийн тоо их байвал зөөлрүүлэх температурыг зохих ёсоор бууруулж болно.Хос праймерын температурын зөрүү 4℃ ~ 6℃ байх нь ПГУ-ын гарцад нөлөөлөхгүй, гэхдээ хос праймерын халаах температур ижил бөгөөд 55℃ ~ 75℃ хооронд хэлбэлзэж болно.
4. Олшруулах загварын хоёрдогч бүтцийн талбайгаас зайлсхий
Олшруулсан фрагментийг сонгохдоо загварын хоёрдогч бүтцийн бүсээс зайлсхийх нь дээр.Зорилтот фрагментийн тогтвортой хоёрдогч бүтцийг холбогдох компьютерийн программ хангамжаар урьдчилан таамаглаж, тооцоолж болох бөгөөд энэ нь загвар сонгоход тустай.Туршилтын үр дүнгээс харахад өргөтгөх бүсийн чөлөөт энерги (△G) 58.6кЖ/моль-ээс бага байвал тэлэлт амжилтгүй болдог.
5. Зорилтот ДНХ-тэй таарахгүй байх
Олшруулсан зорилтот ДНХ-ийн дараалал том бол праймер нь зорилтот ДНХ-ийн олон хэсэгтэй холбогдож, үр дүнд нь олон тууз гарч ирдэг.Энэ удаад BLAST програм хангамжийн тестийг ашиглах шаардлагатай байна, вэб сайт:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Хоёр дарааллыг зэрэгцүүлнэ (bl2seq).
Праймерын дарааллыг 1-р бүс рүү, зорилтот ДНХ-ийн дарааллыг 2-р бүс рүү буулгах нь солигдох боломжтой бөгөөд BLAST нь нэмэлт, антисенс болон бусад боломжуудыг тооцдог тул хэрэглэгчид хоёр хэлхээ мэдрэхүйн хэлхээ мөн эсэхийг анзаарах шаардлагагүй болно.Мөн та өгөгдлийн санд байгаа дарааллын GI дугаарыг мэддэг бол GI дугаарыг оруулах боломжтой тул дарааллын том хэсгийг буулгахгүй.Төгсгөлд нь Align at 3 дээр дарж праймер нь зорилтот ДНХ-д олон гомолог газартай эсэхийг харна.
6. Праймер терминал
Праймерын 3 'төгсгөл нь өргөтгөл эхэлж байгаа газар тул тэнд таарахгүй байхаас урьдчилан сэргийлэх нь чухал.3' төгсгөл нь 3 дараалсан G эсвэл C-ээс ихгүй байх ёстой, учир нь энэ нь G+C баяжуулалтын дарааллын бүсэд праймерыг андуурахад хүргэнэ.3' төгсгөл нь ПГУ-ын (AS-PCR) тусгай урвалаас бусад тохиолдолд хоёрдогч бүтэц үүсгэж чадахгүй, праймерын 3' төгсгөл нь таарахгүй.Жишээлбэл, хэрэв кодлогч мужийг олшруулсан бол кодоны гурав дахь байрлал нь доройтоход өртөмтгий байдаг тул праймерын 3' төгсгөл нь олшруулалтын өвөрмөц байдал, үр ашигт нөлөөлнө.Хавсралт праймерыг ашиглахдаа кодон ашиглалтын хүснэгтийг харна уу, биологийн давуу талыг анхаарч үзээрэй, 3′ төгсгөлд хавсаргах праймерыг бүү ашигла, илүү өндөр концентрацитай праймер (1uM-3uM) хэрэглээрэй.
7. Праймеруудын хоёрдогч бүтэц
Праймерууд нь нэмэлт дараалалтай байх ёсгүй, эс тэгвээс праймерууд өөрсдөө үсний хавчаар бүтэц болж эвхэгддэг бөгөөд энэхүү хоёрдогч бүтэц нь стерик саадаас болж праймер болон загваруудыг холбоход нөлөөлнө.Хэрэв зохиомол дүгнэлтийг ашиглаж байгаа бол праймеруудын тасралтгүй нэмэлт суурь нь 3bp-ээс ихгүй байх ёстой.Хоёр праймерын хооронд нэмэлт зүйл байх ёсгүй, ялангуяа праймер димер үүсэхээс сэргийлэхийн тулд 3' төгсгөлийн нэмэлт давхцлаас зайлсхийх хэрэгтэй.Ерөнхийдөө хос праймерын хооронд 4-өөс илүүгүй дараалсан суурийн ижил төстэй байдал эсвэл нэмэлт байх ёстой.
8. Тэмдэглэгээ эсвэл байршил нэмнэ
5 'төгсгөл нь олшруулалтын өвөрмөц байдалд бага нөлөө үзүүлдэг тул олшруулалтын өвөрмөц байдалд нөлөөлөхгүйгээр өөрчлөх боломжтой.Праймер 5 'төгсгөлийн өөрчлөлт нь дараахь зүйлийг агуулна: ферментийг хязгаарлах газрыг нэмэх;Биотин, флюресцент, дигоксин, Eu3+ гэх мэт шошготой Уураг холбох ДНХ-ийн дарааллыг нэвтрүүлэх;Мутацийн талбайг нэвтрүүлэх, мутацийн дарааллыг оруулах, орхих, промоторын дарааллыг нэвтрүүлэх гэх мэт. Нэмэлт суурь нь олшруулалтын үр ашигт их бага хэмжээгээр нөлөөлж, праймер димер үүсэх боломжийг нэмэгдүүлэх боловч дараагийн алхамд зарим буулт хийх шаардлагатай.Зорилтот дараалалд байхгүй нэмэлт дарааллыг, тухайлбал, хязгаарлалтын газар, дэмжигч дараалалуудыг праймерын 5′ төгсгөлд өвөрмөц байдалд нөлөөлөхгүйгээр нэмж болно.Эдгээр дарааллыг праймер Tm утгын тооцоонд оруулаагүй боловч нэмэлт болон дотоод хоёрдогч бүтцийг шалгах шаардлагатай.
9. Дэд клонууд
Ихэнх тохиолдолд ПГУ нь зөвхөн урьдчилсан клончлол бөгөөд дараа нь бид зорилтот фрагментийг янз бүрийн векторуудад дэд хуваах шаардлагатай байдаг тул ПГУ-ын алхам дахь дараагийн үйл ажиллагааны нэмэлт суурийг бий болгох хэрэгтэй.
Дэд клон хийхэд зориулагдсан зарим дарааллыг доор нэгтгэн үзүүлэв.
Хязгаарлалтын эндонуклеазын хязгаарлалтын талбай нэмэгдсэн
Ферментийн хязгаарлалтын цэгийг нэмэх нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг дэд хуваах хамгийн түгээмэл арга юм.Ерөнхийдөө хагалах хэсэг нь зургаан суурь бөгөөд 5' төгсгөлөөс гадна 2 ~ 3 хамгаалалтын суурийг нэмэх шаардлагатай.Гэсэн хэдий ч өөр өөр ферментүүдэд шаардлагатай хамгаалалтын суурийн тоо өөр өөр байдаг.Жишээлбэл, SalⅠ нь хамгаалалтын суурь шаарддаггүй, EcoRⅤ-д 1 хамгаалалтын суурь, NotⅠ-д 2 хамгаалалтын суурь, Hind Ⅲ-д 3 хамгаалалтын суурь шаардлагатай.
LIC сүүлийг нэмнэ
LIC-ийн бүтэн нэр нь Ligation-Independent cloning бөгөөд Навогенийн pET векторын хэсэгт тусгайлан зориулж бүтээсэн клончлох арга юм.LIC аргаар бэлтгэсэн pET зөөгч нь нэмэлт бус 12-15 үндсэн нэг судалтай наалдамхай үзүүртэй бөгөөд тэдгээр нь зорилтот оруулгын фрагмент дээрх харгалзах наалдамхай үзүүрүүдийг нөхдөг.Олшруулах зорилгоор оруулсан фрагментийн праймер 5' дараалал нь LIC векторыг нөхөх ёстой.T4 ДНХ полимеразын 3′→5′ экстракт идэвхжил нь богино хугацааны дараа оруулсан фрагмент дээр нэг судалтай наалдамхай төгсгөл үүсгэж болно.Бэлтгэсэн оруулгын фрагмент ба векторыг харилцан нөхөх замаар л бүтээгдэхүүн үүсэх боломжтой тул энэ арга нь маш хурдан бөгөөд үр дүнтэй бөгөөд чиглэсэн клонжуулалт юм.
Чиглүүлсэн ТТ клон сүүл нэмнэ
ТТ клончлол нь фрагментийг вектор руу чиглүүлэх боломжгүй байсан тул дараа нь Invitrogen нэг төгсгөлд дөрвөн үндсэн суурь GTGGS агуулсан клончлолыг чиглүүлэх боломжтой векторыг нэвтрүүлсэн.Тиймээс ПГУ-ын праймерын загварт нэмэлт дарааллыг зохих ёсоор нэмж оруулах ёстой бөгөөд ингэснээр фрагментуудыг "баримтлуулах" боломжтой болно.
Хэрэв та цаг зав муутай бол генийг вектортой хослуулан шууд синтез хийхийг оролдож болно, үүнийг бид булчин судлаачид ET генийн синтез гэж нэрлэдэг.
D. In-Fusion клончлох арга
Лигаза шаардлагагүй, удаан хугацааны хариу үйлдэл хийх шаардлагагүй.Шугаманжуулсан векторын хоёр төгсгөлд дарааллыг нэвтрүүлсэн тохиолдолд праймерын загварт ПГУ-ын бүтээгдэхүүн болон шугаман векторыг BSA агуулсан хайлуулах ферментийн уусмалд нэмж, тасалгааны температурт хагас цагийн турш байрлуулснаар хувиргалтыг хийж болно.Энэ арга нь ялангуяа их хэмжээний хөрвүүлэхэд тохиромжтой.
10. Праймерыг нэгтгэх
Заримдаа праймерын дизайны талаар зөвхөн хязгаарлагдмал дарааллын мэдээллийг мэддэг.Жишээлбэл, хэрэв зөвхөн амин хүчлийн дарааллыг мэддэг бол нэгтгэх праймерыг боловсруулж болно.Нэгтгэх праймер нь нэг амин хүчлийг кодлодог өөр өөр суурь боломжуудыг төлөөлдөг өөр өөр дарааллын холимог юм.Өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд та өөр өөр организмын үндсэн хэрэглээний тохиргооны дагуу хавсралтыг багасгахын тулд кодон ашиглалтын хүснэгтээс харж болно.Праймерыг зөөлрүүлэх температурыг багасгахын тулд гипоксантиныг бүх суурьтай хослуулж болно.Праймерын 3′ төгсгөлд хавсаргасан суурийг бүү ашиглаарай, учир нь 3′ төгсгөлд сүүлийн 3 суурийн бэхлэлт нь ПГУ-ыг буруу газар эхлүүлэхэд хангалттай.Олон хавсралтын хольц дахь праймерууд нь зорилтот загварт хамаарахгүй тул праймерын өндөр концентрацийг (1μM-ээс 3μM) ашигладаг.
ПГУ-ын түүхий эдхяналт
1. Праймерын хэмжээ
Праймер бүрийн концентраци нь 0.1 ~ 1umol эсвэл 10 ~ 100pmol байна.Хамгийн бага хэмжээний праймераар шаардлагатай үр дүнг гаргах нь дээр.Праймерын өндөр концентраци нь үл нийцэх, өвөрмөц бус олшруулалтыг үүсгэж, праймеруудын хооронд димер үүсэх боломжийг нэмэгдүүлдэг.
2. Праймерын концентраци
Праймеруудын концентраци нь өвөрмөц байдалд нөлөөлдөг.Праймерын оновчтой концентраци нь ерөнхийдөө 0.1-0.5μM байна.Праймерын өндөр концентраци нь өвөрмөц бус бүтээгдэхүүнийг олшруулахад хүргэдэг.
3. Праймерыг зөөлрүүлэх температур
Праймерын өөр нэг чухал үзүүлэлт бол хайлах температур (Tm) юм.Энэ нь праймер ба нэмэлт дарааллын 50% нь хоёр хэлхээтэй ДНХ молекулууд хэлбэрээр илэрхийлэгдэх температур юм.ПГУ-ын температурыг тохируулахын тулд Tm шаардлагатай.Зориулалтын дараалал бүхий праймеруудыг үр дүнтэй зөөлрүүлэхийн тулд зөөлрүүлэх температур нь хангалттай бага боловч өвөрмөц бус холболтыг багасгахад хангалттай өндөр байдаг.55℃-аас 70℃ хүртэл халаах боломжийн температур.Хуруулалтын температурыг ерөнхийдөө праймерын Tm-ээс 5℃ бага тогтоодог.
Tm-ийг тохируулах хэд хэдэн томъёо байдаг бөгөөд тэдгээр нь ашигласан томъёо болон праймеруудын дарааллаас хамааран ихээхэн ялгаатай байдаг.Ихэнх томьёо нь Tm-ийн тооцоолсон утгыг өгдөг тул бүх дулааны температур нь зөвхөн эхлэлийн цэг юм.Хагалах температурыг аажмаар нэмэгдүүлдэг хэд хэдэн урвалд дүн шинжилгээ хийснээр өвөрмөц байдлыг сайжруулж болно.Тооцоолсон Tm-5℃-аас доош эхэлж, 2℃-ийн өсөлтөөр зөөлрүүлэх температурыг аажмаар нэмэгдүүлнэ.Илүү өндөр температур нь праймер димер болон өвөрмөц бус бүтээгдэхүүн үүсэхийг бууруулдаг.Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд хоёр праймер нь ойролцоогоор Tm утгатай байх ёстой.Хэрэв праймер хосуудын Tm зөрүү 5℃-аас их байвал мөчлөгт бага температурыг ашиглан праймерууд ихээхэн худал эхлэлийг харуулах болно.Хэрэв хоёр праймер Tm өөр бол зөөлрүүлэх температурыг хамгийн бага Tm-ээс 5℃ бага болгож тохируулна уу.Өөрөөр хэлбэл, өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд эхлээд өндөр Tm-д зориулагдсан халаах температурт таван циклийг хийж, дараа нь бага Tm-д зориулагдсан халаах температурт үлдсэн циклийг хийж болно.Энэ нь хатуу нөхцөлд очих загварын хэсэгчилсэн хуулбарыг авах боломжийг олгодог.
4. Праймерын цэвэр байдал, тогтвортой байдал
Захиалгат праймеруудын стандарт цэвэр байдал нь ихэнх ПГУ-ын хэрэглээнд хангалттай байдаг.Бензойл ба изобутилилийн бүлгийг давсгүйжүүлэх замаар зайлуулах нь хамгийн бага тул ПГУ-д саад болохгүй.Зарим програмууд нийлэгжилтийн явцад бүрэн бус дарааллыг арилгахын тулд цэвэршүүлэх шаардлагатай.ДНХ-ийн синтезийн химийн үр ашиг 100% биш учраас эдгээр таслагдсан дараалал үүсдэг.Энэ нь 3′-аас 5′ хүртэлх ДНХ-г бий болгохын тулд суурь бүрийг нэмдэг тул давтан химийн урвал ашигладаг дугуй хэлбэртэй процесс юм.Та аль ч мөчлөгт бүтэлгүйтэж болно.Урт праймерууд, ялангуяа 50-аас дээш тооны суурь нь их хэмжээний таслагдсан дараалалтай байдаг тул цэвэршүүлэх шаардлагатай байж болно.
Праймерын гарц нь синтетик хими, цэвэршүүлэх аргын үр ашигт нөлөөлдөг.Цитологи, Шенгонг зэрэг био эм үйлдвэрлэгч компаниуд олигонуклеозидын нийт гаралтыг баталгаажуулахын тулд хамгийн бага OD нэгжийг ашигладаг.Захиалгат праймерыг хуурай нунтаг хэлбэрээр тээвэрлэдэг.Эцсийн концентрацийг 100μM болгохын тулд праймеруудыг TE-д дахин уусгах нь хамгийн сайн арга юм.TE нь ионгүйжүүлсэн устай харьцуулахад илүү сайн байдаг, учир нь усны рН нь ихэвчлэн хүчиллэг байдаг бөгөөд олигонуклеозидын гидролизийг үүсгэдэг.
Праймеруудын тогтвортой байдал нь хадгалах нөхцлөөс хамаарна.Хуурай нунтаг болон ууссан праймерыг -20 хэмд хадгална.TE-д 10μM-ээс их концентрацид ууссан праймерыг -20℃-т 6 сарын турш тогтвортой хадгалах боломжтой, гэхдээ зөвхөн өрөөний температурт (15℃-аас 30℃) 1 долоо хоногоос бага хугацаанд хадгалах боломжтой.Хуурай нунтаг праймерыг -20С-т дор хаяж 1 жил, тасалгааны температурт (15С-30С) 2 сар хүртэл хадгалах боломжтой.
5. Ферментүүд ба тэдгээрийн концентраци
Одоогийн байдлаар Так ДНХ полимераза нь колиформ бактериар нийлэгжүүлсэн генийн инженерчлэлийн фермент юм.Ердийн ПГУ-ын урвалыг хурдасгахад шаардагдах ферментийн хэмжээ нь ойролцоогоор 2.5U (100ул-ийн нийт урвалын эзэлхүүнийг хэлнэ).Хэрэв концентраци хэт өндөр байвал энэ нь өвөрмөц бус өсгөлтөд хүргэдэг;хэрэв концентраци хэт бага байвал синтетик бүтээгдэхүүний хэмжээ багасна.
6. dNTP-ийн чанар ба концентраци
dNTP-ийн чанар нь ПГУ-ын олшруулалтын концентрац, үр дүнтэй нягт холбоотой байдаг.dNTP нунтаг нь мөхлөг хэлбэртэй бөгөөд буруу хадгалсан тохиолдолд түүний хувирамтгай чанар нь биологийн идэвхээ алддаг.dNTP уусмал нь хүчиллэг бөгөөд өндөр концентрацитай, 1М NaOH эсвэл 1M Tris.HCL буфер уусмалаар PH-ийг 7.0 ~ 7.5 болгон тохируулж, бага хэмжээний савлагаатай, -20 хэмд хөлдөөж хадгална.Олон удаа хөлдөөх гэсгээх нь dNTP-ийг доройтуулна.ПГУ-ын урвалын үед dNTP нь 50 ~ 200umol / л байх ёстой.Ялангуяа дөрвөн DNTPS-ийн концентрацид анхаарлаа хандуулах нь тэнцүү байх ёстой (тэнцүү мэнгэ бэлтгэх).Хэрэв тэдгээрийн аль нэгнийх нь концентраци нь бусдаас ялгаатай (илүү эсвэл бага) байвал үл нийцэх байдал үүснэ.Хэт бага концентраци нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний гарцыг бууруулдаг.dNTP нь Mg2+-тай нэгдэж, чөлөөт Mg2+-ийн концентрацийг бууруулж чаддаг.
7. Загвар (зорилтот ген) нуклейн хүчил
Загварын нуклейн хүчлийн хэмжээ, цэвэршүүлэх зэрэг нь ПГУ-ын амжилт эсвэл бүтэлгүйтлийн гол холбоосуудын нэг юм.Уламжлалт ДНХ цэвэршүүлэх аргууд нь сорьцыг задлах, устгахад ихэвчлэн SDS болон протеаз К-ийг ашигладаг.SDS-ийн үндсэн үүрэг нь: эсийн мембран дээрх липид ба уурагуудыг уусгах, улмаар мембраны уураг уусгах замаар эсийн мембраныг устгах, эс дэх цөмийн уурагуудыг задлах, SDS нь уураг, тунадастай нэгдэж болно;Протеаз К нь уураг, ялангуяа ДНХ-тэй холбогдсон гистонуудыг гидролиз болгож, задлах чадвартай бөгөөд дараа нь органик уусгагч фенол, хлороформыг ашиглан уураг болон эсийн бусад бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ялгаж авах, этанол эсвэл изопропилийн спиртээр нуклейн хүчлийг тунадасжуулах боломжтой.Олж авсан нуклейн хүчлийг ПГУ-ын урвалын загвар болгон ашиглаж болно.Эмнэлзүйн ерөнхий илрүүлэлтийн сорьцын хувьд хурдан бөгөөд энгийн аргыг ашиглан эсийг уусгах, эмгэг төрүүлэгч бичил биетүүдийг задлах, хромосомоос уураг задлах, чөлөөт зорилтот ген гаргах, ПГУ-ын олшруулалтад шууд ашиглах боломжтой.РНХ-ийн загварыг задлахдаа РНХ-ийг задлахаас урьдчилан сэргийлэхийн тулд ихэвчлэн гуанидин изотиоцианат эсвэл протеаз К аргыг ашигладаг.
8.Mg2+ концентраци
Mg2+ нь ПГУ-ын олшруулалтын өвөрмөц чанар, гарцад чухал нөлөө үзүүлдэг.ПГУ-ын ерөнхий урвалд янз бүрийн dNTP-ийн концентраци 200умоль/л байх үед Mg2+-ийн тохирох концентраци нь 1.5 ~ 2.0 ммоль/л байна.Mg2+ концентраци хэт өндөр, урвалын өвөрмөц чанар буурч, өвөрмөц бус олшруулалт үүсдэг, хэт бага концентраци нь Так ДНХ полимеразын идэвхийг бууруулж, урвалын бүтээгдэхүүнийг бууруулдаг.
Магнийн ионууд нь ПГУ-ын хэд хэдэн асуудалд нөлөөлдөг, тухайлбал ДНХ полимеразын идэвхжил нь ургацад нөлөөлдөг;Өөр нэг жишээ бол өвөрмөц байдалд нөлөөлдөг праймерын анивалт юм.dNTP болон загвар нь магнийн ионтой холбогдож, ферментийн үйл ажиллагаанд шаардлагатай чөлөөт магнийн ионы хэмжээг бууруулдаг.Магнийн ионы оновчтой концентраци нь янз бүрийн праймер хос болон загварт харилцан адилгүй байдаг ч 200μM dNTP-тэй ПГУ-ын ердийн эхлэлийн концентраци нь 1.5мМ байна (тэмдэглэл: Бодит цагийн тоон ПГУ-ын хувьд флюресцент датчик бүхий 3-5мМ магнийн ионы уусмалыг ашиглана).Чөлөөт магнийн ионуудын өндөр концентраци нь гарцыг нэмэгдүүлэхээс гадна өвөрмөц бус олшруулалтыг нэмэгдүүлж, үнэнч байдлыг бууруулдаг.Хамгийн оновчтой концентрацийг тодорхойлохын тулд магнийн ионы титрлэлтийг 1 мм-ээс 3 мм хүртэл 0.5 мм-ээр нэмэгдүүлсэн.Магнийн ионы оновчлолын хамаарлыг багасгахын тулд Платинум Так ДНХ полимеразыг ашиглаж болно.Платинум Так ДНХ полимераза нь Так ДНХ полимеразаас илүү өргөн хүрээний магнийн ионы концентрацид ажиллах чадвартай тул оновчлол бага шаарддаг.
9. Pcr-ийг дэмжигч нэмэлтүүд
Ихэнх загваруудыг өндөр нарийвчлалтай өсгөхөд хангалттай температур, праймер дизайн, магнийн ионы концентрацийг оновчтой болгох;Гэсэн хэдий ч зарим загварууд, түүний дотор GC өндөр агуулгатай загварууд нэмэлт арга хэмжээ шаарддаг.ДНХ-ийн хайлах температурт нөлөөлдөг нэмэлтүүд нь бүтээгдэхүүний өвөрмөц чанар, гарцыг сайжруулах өөр нэг арга юм.Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд загварыг бүрэн денатураци хийх шаардлагатай.
Үүнээс гадна хоёрдогч бүтэц нь праймерыг холбох, ферментийн өргөтгөлөөс сэргийлдэг.
ПГУ-ын нэмэлтүүд, тухайлбал формамид, DMSO, глицерин, бетаин, PCRx Enhancer Solution нь олшруулалтыг сайжруулдаг.Тэдгээрийн боломжит механизм нь хайлах температурыг бууруулж, праймерыг нөхөх, хоёрдогч бүтцийн бүсээр дамжин ДНХ полимеразын өргөтгөлийг дэмжих явдал юм.PCRx шийдэл нь бусад давуу талуудтай.Платинум Так ДНХ полимераз ба Платинум Pfx ДНХ полимеразатай хамт хэрэглэхэд магнийн ионы хамгийн бага оновчлол шаардлагатай.Тиймээс Платинум техникийг нэмэлт бодистой хослуулан өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэхийн зэрэгцээ магнийн ионы оновчлолын гуравдахь аргаас хамаарлыг багасгадаг.Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд нэмэлтүүдийн концентрацийг оновчтой болгох хэрэгтэй, ялангуяа Так ДНХ полимеразыг дарангуйлдаг DMSO, формамид, глицерол.
Урьдчилан таамагласан Так ДНХ Полимераз
10. Халуун эхлэл
Халуун эхлэл ПГУ нь сайн праймер дизайнаас гадна ПГУ-ын өвөрмөц байдлыг сайжруулах хамгийн чухал аргуудын нэг юм.Так ДНХ полимеразын суналтын оновчтой температур нь 72℃ боловч өрөөний температурт полимераз идэвхтэй хэвээр байна.Тиймээс ПГУ-ын урвалыг бэлтгэх явцад болон дулааны мөчлөгийн эхэн үед хадгалах температур нь зөөлрүүлэх температураас доогуур байвал өвөрмөц бус бүтээгдэхүүн үйлдвэрлэгддэг.Үүссэний дараа эдгээр өвөрмөц бус бүтээгдэхүүнүүд үр дүнтэйгээр нэмэгддэг.Халуун эхлэх ПГУ нь праймерын дизайн хийхэд ашигласан талбайнууд нь сайт руу чиглэсэн мутаци, экспресс клончлол эсвэл ДНХ-ийн инженерчлэлд ашигладаг генетикийн элементүүдийн бүтэц, зохицуулалт гэх мэт генетикийн элементүүдийн байршлаар хязгаарлагдах үед ялангуяа үр дүнтэй байдаг.
Так ДНХ полимеразын идэвхийг хязгаарлах нийтлэг арга бол мөсөн дээр ПГУ-ын урвалын уусмал бэлтгэж, урьдчилан халаасан ПГУ-ын аппаратанд байрлуулах явдал юм.Энэ арга нь энгийн бөгөөд хямд боловч ферментийн үйл ажиллагааг бүрэн гүйцэд хийж чадахгүй тул өвөрмөц бус бүтээгдэхүүний олшруулагчийг бүрэн арилгадаггүй.
Дулааны праймер нь ПГУ-ын аппаратыг денатурацийн температурт хүрэх хүртэл чухал бүрэлдэхүүн хэсгийг дарангуйлснаар ДНХ-ийн синтезийг удаашруулдаг.Ихэнх гар аргаар дулаан эхлүүлэх аргууд, түүний дотор Так ДНХ полимеразыг хойшлуулах нь ялангуяа өндөр хүчин чадалтай хэрэглээнд төвөгтэй байдаг.Дулааны праймерын бусад аргууд нь магнийн ион эсвэл фермент зэрэг чухал бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг битүүмжлэх эсвэл загвар, буфер зэрэг реактив бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг физик байдлаар тусгаарлахын тулд лав бамбайг ашигладаг.Дулааны мөчлөгийн үед янз бүрийн бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь ялгарч, лав хайлах үед холилддог.Гарын авлагын халуун эхлүүлэх аргын нэгэн адил лаваас хамгаалах арга нь төвөгтэй бөгөөд бохирдолд өртөмтгий бөгөөд өндөр дамжуулах чадвартай хэрэглээнд тохиромжгүй.
Платинум ДНХ полимераз нь автомат халуун эхлүүлэх ПГУ-д тохиромжтой бөгөөд үр дүнтэй байдаг.Платинум Так ДНХ полимераза нь Так ДНХ полимеразын эсрэг моноклональ эсрэгбиетэй хосолсон рекомбинант Так ДНХ полимеразаас бүрдэнэ.Температурыг удаан барих үед ферментийн үйл ажиллагааг дарангуйлахын тулд эсрэгбиемүүдийг ПГУ-аар боловсруулсан.Так ДНХ полимераз нь денатурацийн үе шатыг 94℃ дулаан тусгаарлах явцад урвалд орж, полимеразын идэвхийг бүрэн сэргээсэн.Дулаан үүсгэгч химийн хувьд өөрчлөгдсөн Так ДНХ полимеразаас ялгаатай нь Платинум фермент нь полимеразыг идэвхжүүлэхийн тулд 94℃ (10-15 минут) температурт удаан дулаалах шаардлагагүй.PlatinumTaq ДНХ полимеразын тусламжтайгаар 94 хэмд 2 минутын дараа Taq ДНХ полимеразын 90% идэвхжсэн.
11. Nest-PCR
Суурилуулсан праймеруудыг ашиглан дараалсан олшруулалт нь өвөрмөц байдал, мэдрэмжийг сайжруулдаг.Эхний тойрог нь 15-20 мөчлөгийн стандарт өсгөлт юм.Анхны олшруулалтын бүтээгдэхүүний багахан хэсгийг 100-1000 удаа шингэлж, 15-20 мөчлөгийн турш өсгөлтийн хоёр дахь шатанд нэмсэн.Эсвэл анхны олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээг гель цэвэршүүлэх замаар хийж болно.Эхний праймер доторх зорилтот дараалалтай холбогдож болох хоёр дахь шатанд олшруулсан праймерыг ашигладаг.Праймерын аль алинд нь нэмэлт зорилтот дараалал цөөн байдаг тул үүрлэсэн ПГУ-ын хэрэглээ нь олон зорилтот цэгүүдийг олшруулах боломжийг бууруулдаг.Ижил праймеруудтай ижил мөчлөгийн нийт тоо (30-аас 40) нь өвөрмөц бус газруудыг олшруулсан.Nested PCR нь хязгаарлагдмал зорилтот дарааллын (жишээ нь, ховор mrnas) мэдрэмтгий байдлыг нэмэгдүүлж, хүнд хэцүү PCRS (жишээ нь 5′ RACE)-ийн өвөрмөц байдлыг сайжруулдаг.
12. Буурах ПГУ
Буурах ПГУ нь ПГУ-ын эхний хэдэн мөчлөгт хатуу нөхөх нөхцлийг ашиглан өвөрмөц байдлыг сайжруулдаг.Цикл нь тооцоолсон Tm-ээс ойролцоогоор 5℃ өндөр температурт эхэлдэг ба дараа нь үелэх температур Tm 5℃-аас доош болтол мөчлөг бүр 1℃-аас 2℃-аар буурдаг.Зөвхөн хамгийн өндөр ижил төстэй зорчих газрын загварыг олшруулах болно.Эдгээр бүтээгдэхүүн нь дараагийн мөчлөгт өргөжиж, олшруулсан өвөрмөц бус бүтээгдэхүүнийг шахаж байна.Буурах ПГУ нь AFLP ДНХ-ийн хурууны хээ зэрэг праймер болон зорилтот загвар хоорондын ижил төстэй байдлын зэрэг тодорхойгүй аргуудад хэрэгтэй.
Холбогдох ПГУ-ын иж бүрдэл
2 × ПГУ-ын баатарTMМикс систем нь энгийн ПГУ-ын холимог системээс илүү ПГУ-ын дарангуйлагчийг тэсвэрлэх чадвартай бөгөөд янз бүрийн нарийн төвөгтэй загваруудын ПГУ-ын олшруулалтыг амархан даван туулж чаддаг.Өвөрмөц урвалын систем, өндөр үр ашигтай Taq Hero нь ПГУ-ын урвалыг олшруулах үр ашиг, өвөрмөц чанар, мэдрэмжтэй болгодог.
Өндөр өсгөлтийн үр ашиг
Энэ нь 5'→3' ДНХ полимеразын идэвхжил, 5'→3' экзонуклеазын идэвхжилтэй, 3'→5' экзонуклеазын идэвхгүй.
Бодит цагийн PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Оновчтой буфер ба халуун эхлүүлэх Taq фермент нь өвөрмөц бус олшруулалт болон праймер димер үүсэхээс сэргийлдэг.
Өндөр мэдрэмжтэй-загварын бага хуулбарыг илрүүлэх боломжтой
Энэхүү иж бүрдэл нь Foregene урвуу транскрипцийн өвөрмөц урвалж ба Foregene HotStar Taq ДНХ Полимеразыг хосгүй урвалын системтэй хослуулан олшруулах үр ашиг, урвалын өвөрмөц байдлыг үр дүнтэй сайжруулахад ашигладаг.
Шуудангийн цаг: 2023-05-09
