Тоон ПГУ эсвэл qPCR гэгддэг бодит цагийн ПГУ нь ПГУ-ын олшруулах бүтээгдэхүүний бодит цагийн хяналт, шинжилгээ хийх арга юм.
Тоон ПГУ нь энгийн ажиллагаатай, хурдан бөгөөд тохиромжтой, өндөр мэдрэмжтэй, давтагдах чадвар сайтай, бохирдол багатай зэрэг давуу талтай тул эмнэлгийн шинжилгээ, эмийн үр нөлөөний үнэлгээ, генийн экспрессийн судалгаа, трансген судалгаа, ген илрүүлэх, өвчин үүсгэгч илрүүлэх, амьтан, ургамал илрүүлэх зэрэгт өргөн хэрэглэгддэг., хүнсний туршилт болон бусад салбарууд.
Тиймээс та амьдралын шинжлэх ухааны суурь судалгаа, эмийн үйлдвэр, мал аж ахуйн компани, хүнсний үйлдвэрүүд, тэр ч байтугай орц, гарц, хорио цээрийн товчоо, байгаль орчны хяналтын алба, эмнэлэг, бусад нэгжийн ажилчид ч хамаагүй бага эсвэл бага хэмжээгээр өртөх болно. Эсвэл тоон ПГУ-ыг эзэмших мэдлэгийг мэдэх хэрэгтэй.

Бодит цагийн ПГУ-ын зарчим

Бодит цагийн ПГУ нь ПГУ-ын урвалын системд флюресцент бодис нэмж, ПГУ-ын урвалын үйл явц дахь флюресценцийн дохионы эрчмийг тоон ПГУ-ын хэрэглүүрээр бодит цаг хугацаанд хянаж, эцэст нь туршилтын өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийж, боловсруулдаг арга юм.

【Олшруулах муруй】Энэ нь ПГУ-ын динамик процессыг дүрсэлсэн муруй юм.ПГУ-ын олшруулалтын муруй нь үнэндээ стандарт экспоненциал муруй биш, харин сигмоид муруй юм.

[Өсгөх муруйн платформ үе шат]ПГУ-ын мөчлөгийн тоо нэмэгдэж, ДНХ полимераза идэвхгүй болох, dNTP ба праймерууд шавхагдах, пирофосфатын дайвар бүтээгдэхүүн гэх мэт синтезийн урвалыг дарангуйлах зэргээр ПГУ үргэлж экспоненциалаар өргөжиж чаддаггүй., эцэст нь тэгш өндөрлөгт орно.

[Өсгөх муруйн экспоненциал өсөлтийн бүс]Хэдийгээр өндөрлөг үе шат нь ихээхэн ялгаатай боловч олшруулалтын муруйн экспоненциал өсөлтийн бүсийн тодорхой бүсэд давтагдах чадвар маш сайн байдаг нь ПГУ-ын тоон шинжилгээнд маш чухал юм.

[Босго утга ба Ct утга]Бид флюресцент илрүүлэх хязгаарын утгыг олшруулалтын муруйн экспоненциал өсөлтийн талбайн зохих байрлалд, тухайлбал босго утга (Босго) дээр тогтооно.Босго утга ба олшруулалтын муруй хоёрын огтлолцол нь Ct утга бөгөөд өөрөөр хэлбэл Ct утга нь босго утгад хүрэх үеийн мөчлөгийн тоог (Босго мөчлөг) хэлнэ.

Доорх график нь босго шугам ба олшруулалтын муруй, босго болон Ct утгын хоорондын хамаарлыг тодорхой харуулж байна.

【Хэрхэн тоолох вэ?】

Ct утга нь анхны загваруудын тооны логарифмтай урвуу шугаман хамааралтай болохыг математикийн онолоор баталсан.Бодит цагийн ПГУ нь ПГУ-ын олшруулалтын бүтээгдэхүүнийг бодит цаг хугацаанд нь хянаж, экспоненциал олшруулалтын үе шатанд тэдгээрийн хэмжээг тодорхойлдог.

ПГУ-ын мөчлөг бүрт ДНХ 2 дахин ихэсч, удалгүй өндөрлөгт хүрэв.

Эхлэх ДНХ-ийн хэмжээг А гэж үзвэл₀ , n мөчлөгийн дараа ДНХ-ийн бүтээгдэхүүний онолын хэмжээг дараах байдлаар илэрхийлж болно.

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Дараа нь анхны ДНХ-ийн хэмжээ A 0 байх тусам олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээ нь илрүүлэх утгад хурдан хүрэх ба An-д хүрэх мөчлөгийн тоо нь Ct утга болно.Өөрөөр хэлбэл, ДНХ-ийн анхны хэмжээ A 0 байх тусам олшруулалтын муруй хамгийн дээд цэгтээ хүрч, шаардлагатай n мөчлөгийн тоо бага байна.

Бид мэдэгдэж буй концентрацийн стандартын градиент шингэрүүлэлтийг хийж, үүнийг бодит цагийн ПГУ-ын загвар болгон ашигладаг бөгөөд ДНХ-ийн хэмжээг ихээс бага хүртэл эхлүүлэх дарааллаар тэнцүү интервалтайгаар хэд хэдэн олшруулалтын муруйг авах болно.Ct утга ба эхлэлийн загваруудын тооны логарифмын шугаман хамаарлын дагуу[стандарт муруй] үүсгэж болно.

Үл мэдэгдэх концентрацтай дээжийн Ct утгыг стандарт муруйд орлуулснаар тодорхойгүй концентрацитай дээжийн анхны загвар хэмжээг авах боломжтой бөгөөд энэ нь бодит цагийн ПГУ-ын тоон зарчим юм.

Бодит цагийн ПГУ-ын илрүүлэх арга

Бодит цагийн ПГУ нь урвалын систем дэх флюресценцийн эрчмийг илрүүлэх замаар ПГУ-ын олшруулах бүтээгдэхүүнийг илрүүлдэг.

Флюресцент будгийг суулгах аргын зарчим】

Флюресцент будагTB Green ® гэх мэт нь ПГУ-ын систем дэх хоёр хэлхээтэй ДНХ-тэй өвөрмөц бус холбогдож, холбогдох үед флюресцент үүсгэдэг.

ПГУ-ын мөчлөг нэмэгдэхийн хэрээр урвалын систем дэх флюресценцийн эрчим нь экспоненциалаар нэмэгдсэн.Флюресценцийн эрчмийг илрүүлснээр урвалын систем дэх ДНХ-ийн олшруулалтын хэмжээг бодит цаг хугацаанд хянаж, дараа нь дээж дэх эхлэлийн загварын хэмжээг урвуу байдлаар тооцоолж болно.

【Флюресцент датчикийн аргын зарчим】

флюресцент датчикЭнэ нь загвартай тусгайлан холбогдож чаддаг 5′ төгсгөлд флюресцент бүлэг, 3′ төгсгөлд бөхөөх бүлэгтэй нуклейн хүчлийн дараалал юм.Зоног бүрэн бүтэн байх үед флюрофороос ялгарах флюресценц нь унтрах бүлэгт унтардаг бөгөөд флюресцлэх боломжгүй байдаг.Сорьц задрахад флюресцент бодис нь салж, флюресцент ялгаруулна.

Флюресцент мэдрэгчийг ПГУ-ын урвалын уусмалд нэмнэ.Цэвэрлэх явцад флюресцент датчик нь загварын тодорхой байрлалд холбогдоно.Өргөтгөх процессын явцад ПГУ-ын ферментийн 5′→3′ экзонуклеазын идэвхжил нь загвартай эрлийзжүүлсэн флюресцент датчикийг задалж, флюресцент бодис нь флюресцент ялгаруулахын тулд задрах боломжтой.Урвалын систем дэх датчикийн флюресценцийн эрчмийг илрүүлснээр ПГУ-ын бүтээгдэхүүний олшруулалтын хэмжээг хянах зорилгод хүрч болно.

【Флюресценц илрүүлэх аргыг сонгох】

Хэрэв энэ нь өндөр ижил төстэй дарааллыг ялгах, SNP бичих шинжилгээ гэх мэт мультиплекс ПГУ-ын илрүүлэхэд ашиглагддаг бол флюресцент датчикийн аргыг орлуулшгүй.
Бодит цагийн бусад ПГУ-ын туршилтуудын хувьд энгийн, хялбар, хямд өртөгтэй флюресцент химерийн аргыг ашиглаж болно.

probesХүчтэй өвөрмөц чанар, мультиплекс ПГУ-ын чадвартай

Дутагдал

Олшруулахад өндөр өвөрмөц байдлын шаардлага;

олон талт ПГУ-ыг хийх боломжгүй Тодорхой датчикуудыг зохион бүтээх шаардлагатай, өндөр өртөгтэй;

заримдаа датчикийн дизайн хэцүү байдаг

Холбоотой бүтээгдэхүүн: