RT-qPCR бол молекул биологийн үндсэн туршилт бөгөөд хүн бүр үүнийг мэддэг байх ёстой.Энэ нь үндсэндээ гурван үе шатыг агуулдаг: РНХ олборлолт, cDNA руу урвуу транскрипц, бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ.Энэ нь тус болохгүй, юу болоод байна вэ?Асуудал гарсан байх магадлалтайурвуу транскрипцийн туршилт!Хэдийгээр урвуу транскрипцийн туршилтанд зөвхөн РНХ, dNTP, праймер, болонурвуу транскриптазацентрифугийн хоолой руу хийж сайтар холино, гэхдээ бодит үйл ажиллагааны явцад анхаарах ёстой олон нарийн ширийн зүйл байсаар байна.Энэ талаар сурцгаая!

РНХ-ийн чанарыг хэрхэн үнэлэх вэ?
cDNA авахын тулд РНХ-ийн чанар чухал юм!РНХ-ийн чанарыг үндсэн хоёр талаас нь илрүүлж болно.
(1) РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал:РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг агароз гель электрофорезоор шалгаж болно. Эукариотуудыг жишээ болгон авч үзвэл, бүхэл бүтэн РНХ нь гурван тунгалаг зурвастай, томоос жижиг хүртэлх молекулын жин нь 28S, 18S, 5S, 28S нь 18S-ээс хоёр дахин тод;хэрэв гурван тууз харагдах боловч туузны төрөл нь бүдэгэрсэн эсвэл тархалт нь РНХ хэсэгчлэн доройтсон гэсэн үг юм.Энэ үед урвуу транскрипцийн урвалыг нэн даруй хийж, загварын оролтыг зохих ёсоор нэмэгдүүлнэ үү;Хэрэв зөвхөн жижиг молекул жинтэй тууз харагдахгүй бол РНХ бүрэн доройтсон тул дахин гаргаж авах шаардлагатай болно.Agilent 2100 нь оргил диаграмм болон RIN утга бүхий РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг харуулж байна.Хэрэв нуклейн хүчил бүрэн бүтэн байвал электроферограммын суурь нь тэгш байна;хэрэв нуклейн хүчил хүчтэй доройтсон бол суурь нь жигд бус, илүү их задралын оргилууд гарч ирдэг;RIN-ийн утга нь РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг илэрхийлдэг бөгөөд 0-10-ийн хооронд байх тусам утга нь том байх тусам РНХ-ийн чанар сайжирна.За, бүрэн байдлын зэрэг нь өндөр байх болно.
(2) РНХ-ийн цэвэр байдал:OD260/280 харьцааг хэт ягаан туяаны спектрофотометрээр илрүүлж болно.Хэрэв OD260/280-ийн харьцаа 1.9-2.1 хооронд байвал цэвэршилт маш сайн байна.
Үлдэгдэл геномын ДНХ нь буруу тоон үр дүнд хүргэдэг
РНХ-г задлахад бидний олж авсан РНХ нь цэвэрлэгдээгүй геномын ДНХ (гДНХ)-тай холилдож болно.Тиймээс урвуу транскрипцийн дараах cDNA нь мөн холилдох болногДНХ.Доод урсгалын үеэрqPCRурвал,cDNAба гДНХ-ийг нэгэн зэрэг олшруулж, CT-ийн үнэ цэнэ харьцангуй бага байх тул үр дүн нь өрөөсгөл байж болно.
Ийм нөхцөлд бид юу хийх ёстой вэ?Гадаадсанал болгож байна:
(1) РНХ-ийг задлах явцад баганын олборлолтоор арилгаж болох урвуу РНХ дээр геномын цэвэрлэгээ хийх;
(2) Олж авсан РНХ-г ДНазаар эмчилнэI , гэхдээ EDTA-аар дуусгах;
урвуу транскрипцийн урвалжуудынгеном цэвэрлэх модулиудтай;

Урвуу транскрипцийн праймерыг хэрхэн сонгох вэ?
Урвуу транскрипцийн праймерууд нь урвуу транскрипцийн урвалын үр дүнд нөлөөлдөг.Туршилтын тодорхой нөхцөл байдлын дагуу урвуу транскрипцид зориулж санамсаргүй праймер, Oligo dT эсвэл генийн өвөрмөц праймерыг сонгож болно.
(1) Тодорхой хуулбарууд: генийн өвөрмөц праймерыг санал болгож байна;
(2) Урт фрагментийн хуулбар: Oligo dT/генийн өвөрмөц праймерыг хэрэглэхийг зөвлөж байна;
(3) Урт сегментийн транскриптийн дотоод хэсгүүд: генийн өвөрмөц праймер/ санамсаргүй праймер / санамсаргүй праймер + Олиго dT.Хэрэв дараагийн qPCR туршилтыг хийвэл Oligo dT-г дангаар нь ашиглах боломжгүй, учир нь Oligo dT-г дангаар нь ашиглах нь 3′ төгсгөлийн хазайлт үүсгэж, qPCR туршилтын үр дүн буруу гарахад хүргэдэг;
(4) миРНХ: Үүдэл гогцооны праймер эсвэл хаягдлын праймерыг ашиглаж болно.

Урвуу транскрипцийн бүтээгдэхүүн cDNA-г хэдэн удаа шингэлэх шаардлагатай вэ?
Урвуу транскрипцийн бүтээгдэхүүний cDNA-г олж авсны дараа cDNA-г qPCR туршилтанд хэдэн удаа шингэлэх нь маш чухал юм.Хэрэв cDNA-ийн концентраци хэт өндөр эсвэл хэт бага байвал олшруулах үр ашигт нөлөөлж болно.cDNA-ийн концентрацийг хэмжиж болох уу, үүнийг хэрхэн хийх ёстой вэ?
(1) Урвуу транскрипцийн бүтээгдэхүүний cDNA-ийн концентрацийг хэмжих боломжгүй, учир нь урвуу транскрипцийн бүтээгдэхүүн нь cDNA бүтээгдэхүүнээс гадна урвуу транскрипцийн үлдэгдэл буфер, урвуу транскриптаза, праймер гэх мэтийг агуулж байгаа нь концентрацийн хэмжилтийн үр дүнд саад болж, OD260/280, OD260/хэвийн харьцааг зөв тусгаагүй тул OD230D-ийн харьцаа буруу байна.Энэ үед зарим найзууд хэлэх болно, дараа нь би цэвэршүүлсний дараа концентрацийг хэмжих болно;Энд, Foregene cDNA-г цэвэршүүлэхийг зөвлөдөггүй, учир нь урвуу аргаар олж авсан cDNA-ийн урт нь өөр бөгөөд цэвэршүүлэх явцад богино cDNA алдагдах болно гэдгийг сануулмаар байна.
(2) Тэгэхээр юу хийх вэ?qPCR туршилтын өмнө cDNA-ийн шингэрүүлэлтийн градиентийг урьдчилсан туршилтаар тодорхойлж болно.Жишээ нь: cDNA-ийн нөөцийн уусмал, 10 дахин шингэрүүлэлт, 100 дахин шингэрүүлэлтийг qPCR туршилтын загвар болгон ашиглаж, CT утга бүхий шингэрүүлэлтийн коэффициентийг 18-28 хооронд сонгоно.

МиРНХ-г хэрхэн урвуу хуулбарлах вэ?
миРНХ нь нэг судалтай жижиг молекул РНХ бөгөөд 22 нт хэмжээтэй, уураг кодлодоггүй.Богино урттай тул уламжлалт qPCR арга нь шууд тоон үзүүлэлтийг тодорхойлоход хэцүү байдаг тул ихэнхдээ miRNA-г сунгах шаардлагатай байдаг;миРНХ-ийн урвуу транскрипцийн түгээмэл хэрэглэгддэг аргууд нь ишний гогцоо ба хаягдлын арга юм.
Үүдэл гогцооны арга нь үүдэл гогцооны праймеруудыг нэмж миРНХ-ийг өргөтгөх явдал юм.Энэ илрүүлэх арга нь илүү өндөр мэдрэмж, өвөрмөц шинж чанартай боловч илрүүлэх чадвар бага байдаг.Нэг урвуу транскрипц нь зөвхөн нэг miRNA болон дотоод лавлагааг илрүүлэх боломжтой;сүүл нэмэх арга нь хоёроос бүрддэг Энэ нь полиА полимераз ба урвуу транскриптаза гэсэн хоёр ферментийн хамтарсан үйл ажиллагааны үр дүнд төгсдөг.ПолиА полимераз нь miRNA-д PolyA сүүлийг нэмж уртыг нь нэмэгдүүлэх үүрэгтэй бөгөөд урвуу транскриптаза нь урвуу транскрипцийн урвалыг гүйцэтгэдэг.Энэ арга нь илрүүлэх өндөр хүчин чадалтай бөгөөд нэг урвуу транскрипцээр олон миРНХ болон дотоод лавлагааг илрүүлэх боломжтой боловч ишний гогцооны аргын мэдрэмж, өвөрмөц чанар бага байдаг.