Илрүүлэх онцлог

Ихэнх тохиолдолд праймер дизайны зорилго нь ПГУ-ын өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэх явдал юм.Энэ нь олон хувьсагчийн урьдчилан таамаглах боломжтой нөлөөллөөр тодорхойлогддог.Нэг чухал хувьсагч бол праймерын 3′ төгсгөлд байгаа дараалал юм.

Хамгийн чухал нь, өвөрмөц байдалд зориулагдсан ПГУ-ын шинжилгээ нь өргөн динамик мужид өндөр үр ашгийг хадгалах магадлал өндөр байдаг, учир нь уг шинжилгээ нь өвөрмөц бус өсгөлтийн бүтээгдэхүүн үүсгэдэггүй, улмаар ПГУ-ын урвалжуудтай өрсөлддөг эсвэл олшруулах үндсэн урвалыг дарангуйлдаг.

Мэдээжийн хэрэг, зарим тохиолдолд өвөрмөц байдал нь хамгийн чухал биш юм, жишээлбэл, зорилго нь хоорондоо нягт холбоотой боловч өөр өөр эмгэг төрүүлэгчдийн тоог тодорхойлоход тусгай загвар, оновчлол, баталгаажуулалтын стандарт шаардлагатай байдаг.

Хайлах муруй нь ампликонуудын өвөрмөц байдлыг үнэлэх стандарт арга бөгөөд наад зах нь нэг зорилтыг өсгөх эсэхээс хамаарна.Гэсэн хэдий ч хайлах муруй нь төөрөгдүүлсэн байж болохыг онцлон тэмдэглэх нь зүйтэй, учир нь жишээлбэл, тэдгээрт дутуу праймер болон загвар бага концентрацийн хосолсон нөлөө нөлөөлж болно.

P5 |Хайлах муруй нь хоёр зорилтот ДНХ-ийн өөр өөр хэмжээтэй хоёр илрүүлэлтийн үр дүнд олж авсан Tm шилжилтийг харуулж байна.

A. Илүү өндөр концентрацид (ad)) qPCR хэмжилт дууссаны дараа тодорхой праймер димер байхгүй болно.Загварын концентраци 50 хувь (e) болж буурах үед өвөрмөц бус бүтээгдэхүүн гарч ирж эхэлдэг бөгөөд хамгийн бага концентрацитай (f) цорын ганц бүтээгдэхүүн болдог.

B. Туршилт нь бүх зорилтот концентрацид ижил Tms-ийг бүртгэсэн бөгөөд хамгийн бага концентрацид ч (5 хувь) илэрхий праймер димер байгаагүй.Илрүүлэх эдгээр хоёр аргыг ашиглах үед ГССҮТ-д олшруулах бүтээгдэхүүн илрээгүй.

P5 нь загвар нь өөр өөр концентрацитай байдаг дээжээс олж авсан уусалтын муруйг харуулж байна.P 5a нь хамгийн бага хоёр концентрацитай үед үйлдвэрлэсэн өвөрмөц бус өсгөлтийн бүтээгдэхүүний Tms нь тодорхой ампликонуудаас бага байгааг харуулж байна.

Энэ илрүүлэх аргыг бага концентрацид байгаа байг илрүүлэхэд найдвартай ашиглах боломжгүй нь ойлгомжтой.

Сонирхолтой нь, NTC-үүд, өөрөөр хэлбэл ДНХ-гүй дээжүүд (өвөрмөц бус) олшруулалтын бүтээгдэхүүнийг бүртгээгүй нь геномын арын ДНХ нь өвөрмөц бус олшруулалт/полимержилтэд оролцох боломжтойг харуулж байна.

Заримдаа ийм дэвсгэр праймерууд болон өвөрмөц бус олшруулалтыг засч залруулах боломжгүй боловч ямар ч загварын концентраци болон NTC (P 5b) -д өвөрмөц бус олшруулалтгүй илрүүлэх аргыг зохион бүтээх боломжтой байдаг.

Энд Cq 35-аар зорилтот концентрацийн олшруулалтыг бүртгэсэн ч тодорхой уусалтын муруй гарна.Үүний нэгэн адил ГССҮТ-д өвөрмөц бус өсгөлтийн шинж тэмдэг илрээгүй.Заримдаа илрүүлэх зан үйл нь эхийн архинаас хамааралтай байж болох бөгөөд зөвхөн өвөрмөц бус олшруулалтыг тодорхой буферийн найрлагад илрүүлдэг бөгөөд энэ нь өөр өөр Mg2+ концентрацитай холбоотой байж болно.

Илрүүлэх тогтвортой байдал

Ta-ийн оновчлол нь qPCR илрүүлэх эмпирик баталгаажуулалт, оновчлолын үйл явцад хэрэгтэй алхам юм.Энэ нь NTC-ийг өсгөхгүйгээр хамгийн бага Cq үүсгэдэг температурыг (эсвэл температурын хүрээ) харуулах замаар праймерын бат бөх байдлын шууд үзүүлэлтийг өгдөг.

МРНХ-ийн илэрхийлэл өндөртэй хүмүүст мэдрэмтгий байдлын 2-4 дахин зөрүү нь чухал биш байж болох ч оношилгооны шинжилгээнд эерэг ба хуурамч сөрөг үр дүнгийн ялгааг илэрхийлж болно.

qPCR праймеруудын Ta шинж чанар нь ихээхэн ялгаатай байж болно.Зарим туршилтууд нь тийм ч бат бөх биш бөгөөд хэрэв тэдгээрийг праймеруудын хамгийн оновчтой Ta утгын дор хийхгүй бол хурдан нурах болно.

Энэ нь чухал бөгөөд учир нь энэ төрлийн илрүүлэлт нь бодит ертөнцөд ихэвчлэн асуудалтай байдаг бөгөөд дээжийн цэвэр байдал, ДНХ-ийн концентраци эсвэл бусад ДНХ байгаа эсэх нь оновчтой биш байж болно.

Нэмж дурдахад, зорилтот хуулбарын тоо нь өргөн хүрээний хувьд өөр өөр байж болох бөгөөд урвалж, хуванцар сав суулга, багаж хэрэгсэл нь туршилтыг тохируулахдаа ашигласан хэмжээнээс өөр байж болно.

P6|Температурын градиент нь ПГУ-ын илрүүлэлтийн өөр өөр бат бөх чанарыг харуулж байна.

A. Хүний тархины РНХ-ээс бэлтгэсэн cDNA дээр ПГУ-ыг хийхийн тулд Bioline-ийн Sensifast SYBR мастермикс (каталогийн дугаар BIO-98050) ашиглана.

B. Bio-Rad-ын CFX qPCR багажийг ашиглан апалены олшруулалтын зураг болон уусалтын муруйг бүртгэнэ (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1-ийн олшруулалтын график ба хайлах муруй (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP-ийн олшруулалтын график ба уусалтын муруй (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).

E. 7С-ийн температурын градиент дор бүртгэгдсэн Cq-ийн зөрүүг харуулсан өөр өөр температурт бүртгэсэн Cq.

P 6 нь хүсээгүй сорилтын ердийн үр дүнг харуулж байгаа бөгөөд qPCR нь хүний ​​тархины өвөрмөц гурван генийн праймерыг ашиглан 59C-67C (P 6a) хооронд Tas градиент ашиглан хийсэн.

Олшруулах графикаас харахад опалин праймерууд нь оновчтой байхаас хол байна, учир нь тэдгээрийн оновчтой Ta хүрээ нь маш нарийхан (Зураг 6б), өөрөөр хэлбэл, Cq нь өргөн тархсан тул Cq нь оновчтой Cqs Low-той харьцуулахад мэдэгдэхүйц байна.

Энэ илрүүлэх арга нь тогтворгүй бөгөөд оновчтой бус өсгөлтөд хүргэж болзошгүй.Тиймээс энэ хос праймерыг дахин төлөвлөх хэрэгтэй.Нэмж дурдахад хайлах муруйн шинжилгээ (оруулга) нь Ta бүрийн хайлах муруй өөр өөр байдаг тул энэ илрүүлэх аргын онцлог нь бас асуудалтай байж болохыг харуулж байна.

P 6c-д үзүүлсэн ACSBG1 илрүүлэх арга нь дээрх Opalin илрүүлэх аргаас илүү бат бөх боловч энэ нь тийм ч тохиромжтой биш бөгөөд үүнийг сайжруулах боломжтой юм.

Гэсэн хэдий ч бат бөх байдал ба өвөрмөц байдлын хооронд зайлшгүй холбоо байхгүй гэдгийг онцлон тэмдэглэж байна, учир нь энэхүү илрүүлэх аргын дагуу үүссэн уусалтын муруй нь бүх Tas (оруулга) дээр ижил оргил утгыг харуулдаг.

Нөгөөтэйгүүр, бат бөх байдлын тест нь P 6d-д үзүүлсэн GFAP тестийн адил өргөн хүрээний Tas-д ижил төстэй Cq-уудыг үүсгэдэг илүү тэсвэртэй байдаг.

Цельсийн 8 градусын ижил мужид олж авсан Cq-ийн зөрүү нь 1-ээс бага бөгөөд уусалтын муруй (оруулга) нь энэ температурын муж дахь илрүүлэх шинж чанарыг баталгаажуулдаг.Тооцоолсон Tas болон бодит Ta муж нь маш өөр байж болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй.

Судлаачдад үр ашигтай праймерыг зохион бүтээхэд туслах зорилготой олон удирдамж байдаг бөгөөд тэдгээрийн ихэнх нь удаан хугацааны туршид тогтсон дүрэм журамд үндэслэсэн байдаг бөгөөд праймеруудын 3′ төгсгөлд ихээхэн анхаарал хандуулдаг.Ихэнхдээ 3' төгсгөлд G эсвэл C, хоёр G эсвэл C суурийг (GC хавчаар) оруулахыг зөвлөж байна, гэхдээ сүүлийн 5 суурийн хоёроос илүүгүй байна.

Практикт эдгээр дүрмүүд нь судлаачдыг чиглүүлж болох ч бүх нөхцөл байдалд зөв байх албагүй.

P7 |Праймерын 3′төгсгөл нь өвөрмөц байдал, үр ашигт бага нөлөө үзүүлдэг.

A. Хүний HIF-1α (NM_181054.2) генийн праймеруудын байрлал.

B. Туршилтын зургаан зүйлийг нэмэгдүүлэхийн тулд Agilent Brilliant III SYBR Green эх ликёрыг (Cat. No. 600882) ашиглана.

C. Bio-Rad-ын CFX qPCR төхөөрөмж болон 3′-төгсгөлийн праймераар тэмдэглэсэн олшруулалтын график ба хайлах муруй.NTC-г улаанаар харуулсан.

D. Шалгалтын зүйл бүрийн Cqs бүртгэл

Жишээлбэл, P 7 дахь үр дүн нь 3′төгсгөлийн дүрэмтэй зөрчилдөж байна.Бүх загварууд нь үндсэндээ ижил үр дүнг өгдөг бөгөөд зөвхөн хоёр праймерын хослол нь NTC-ийн өвөрмөц бус өсгөлтөд хүргэдэг.

Гэсэн хэдий ч бид GC клипийн үр нөлөөг дэмжих боломжгүй, учир нь энэ тохиолдолд A эсвэл T-г дээд тал нь 30 суурь болгон ашиглах нь өвөрмөц байдлыг бууруулдаггүй.

F праймер нь GGCC-д төгсдөг C тест нь NTC-д Cq-г бүртгэсэн нь 30-ийн төгсгөлд эдгээр дарааллаас зайлсхийхийг хүсч болохыг харуулж байна.Праймерын хосын хамгийн сайн 3′-ийн дарааллыг тодорхойлох цорын ганц арга бол зарим нэр дэвшигч праймеруудыг туршилтаар үнэлэх явдал гэдгийг бид онцолж байна.

Олшруулах үр ашиг

Хамгийн чухал нь, өвөрмөц бус ПГУ-ын илрүүлэлт хэзээ ч өвөрмөц болж чадахгүй ч фермент, эхийн шингэн, нэмэлт бодис, эргэлтийн нөхцөлийг өөрчилснөөр олшруулалтын үр ашгийг олон янзын аргаар тохируулж, нэмэгдүүлэх боломжтой.

ПГУ-ын илрүүлэлтийн үр ашгийг үнэлэхийн тулд зорилтот нуклейн хүчлээс 10 эсвэл 5 дахин их хэмжээний цуваа шингэрүүлэлт, өөрөөр хэлбэл "стандарт муруй арга" -ыг ашиглах нь зүйтэй.

Хэрэв стандарт муруй үүсгэхийн тулд ПГУ-ын ампликонууд эсвэл синтетик ДНХ-ийн зорилтуудыг ашигладаг бол эдгээр зорилтуудын цуваа шингэрүүлэлтийг тогтмол хэмжээний дэвсгэр ДНХ-тэй (геномын ДНХ гэх мэт) холино.

P8 |ПГУ-ын үр ашгийг үнэлэх шингэрүүлэлтийн муруй.

A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ба R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC болон Agilent's Brilliant III SYBR Green мастер хольцыг (каталогийн дугаар 600882) ПГУ болон хайлах муруйн нөхцөлд хэрэглэх праймеруудыг ашиглана.

B. 100 нг РНХ-ийг урвуу хуулбарлаж, 2 удаа шингэлж, цуваа шингэрүүлсэн cDNA дээжийг 1 нг хүний ​​геномын ДНХ хүртэл 5 удаа шингэлэв.Хайлах муруйг оруулгад харуулав.

C. Хоёр дахь cDNA дээжинд RT урвал, шингэрүүлэлт, цуваа шингэрүүлэлт давтагдсан бөгөөд үр дүн нь ижил байв.

P 8 нь хоёр өөр cDNA дээж дээр ижил илрүүлэх аргыг ашиглан хоёр стандарт муруйг харуулж байгаа бөгөөд үр дүн нь ижил үр ашигтай, ойролцоогоор 100%, R2 утга нь мөн адил төстэй, өөрөөр хэлбэл туршилтын өгөгдөл болон регрессийн шугам эсвэл өгөгдлийн шугаман байдлын зэрэг хоорондын тохирлын зэрэг юм.

Хоёр стандарт муруйг харьцуулж болох боловч яг адилхан биш.Хэрэв зорилго нь зорилтот тоог үнэн зөв тодорхойлох зорилготой бол тодорхойгүй байдлыг тайлбарлахгүйгээр хуулбарын дугаарыг тооцоолох нь хүлээн зөвшөөрөгдөхгүй гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

P9 |Стандарт муруй ашиглан хэмжилт хийхтэй холбоотой хэмжилтийн тодорхойгүй байдал.

A. ПГУ болон хайлах муруй нөхцөлийг гүйцэтгэхийн тулд GAPDH (NM_002046) праймеруудыг ашиглана.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ба R: TAACTGGTTGAGCACAGG болон Bioline-ийн Sensifast SYBR мастер хольц (каталогийн дугаар BIO-98050).

B. Bio-Rad-ын CFX qPCR багажаар тэмдэглэсэн олшруулалтын график, хайлах муруй болон стандарт муруй.

C. Стандарт муруй график ба 95% итгэлийн интервал (CI).

D. Шингэрүүлэх муруйгаас гаргаж авсан гурван Cq ​​утгын хуулбарын дугаар ба 95%-ийн итгэлийн интервал.

P 9 нь оновчтой туршилтын хувьд нэг стандарт муруйны төрөлхийн хувьсах чанар нь ойролцоогоор 2 дахин их байдаг (95% итгэлийн интервал, хамгийн багааас дээд тал нь) бөгөөд энэ нь хүлээгдэж болох хамгийн бага хэлбэлзэл байж болох юм.

Холбоотой бүтээгдэхүүн:

Cell Direct RT qPCR Kit

Хулганы сүүлний шууд ПГУ-ын иж бүрдэл

Амьтны эдийн шууд ПГУ-ын иж бүрдэл