Cell Direct RT qPCR Kit—SYBR GREEN I Шууд эсийн задралын эсийн бэлэн нэг алхамт qRT-PCR иж бүрдэл
Тодорхойлолт
Энэхүү иж бүрдэл нь RT-qPCR урвалд зориулж өсгөвөрлөсөн эсийн дээжээс РНХ-ийг хурдан гаргаж чаддаг өвөрмөц лизисын буфер системийг ашигладаг бөгөөд ингэснээр цаг хугацаа шаардсан, хөдөлмөр их шаарддаг РНХ цэвэршүүлэх процессыг арилгадаг.РНХ-ийн загварыг ердөө 7 минутын дотор авах боломжтой.5×Шууд RT Mix болон 2×Иж бүрдэлд нийлүүлсэн шууд qPCR Mix-SYBR урвалжууд нь бодит цагийн тоон ПГУ-ын үр дүнг хурдан бөгөөд үр дүнтэй авах боломжтой.
5×Шууд RT Mix болон 2×Шууд qPCR Mix-SYBR нь дарангуйлагчийг тэсвэрлэх чадвартай бөгөөд дээжийн лизатыг RT-qPCR-д шууд загвар болгон ашиглаж болно.Энэхүү иж бүрдэл нь өвөрмөц РНХ-ийн өндөр хамааралтай Foregene урвуу транскриптаза, халуун D-Taq ДНХ полимераз, dNTPs, MgCl агуулдаг.2, урвалын буфер, ПГУ-ын оновчтой, тогтворжуулагч.
Үзүүлэлтүүд
200×20μл Rxns, 1000×20μl Rxns
Иж бүрдэл хэсгүүд
| I хэсэг | Буфер CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| буфер ST | |
| II хэсэг | ДНХ баллуур |
| 5 × Шууд RT Mix | |
| 2× Шууд qPCR Mix-SYBR | |
| 50 × ROX лавлагаа будаг | |
| RNase-гүй ddH2O | |
| Зааварчилгаа | |
Онцлог, давуу тал
■Энгийн бөгөөд үр дүнтэй: Cell Direct RT технологийн тусламжтайгаар РНХ-ийн дээжийг ердөө 7 минутын дотор авах боломжтой.
■ Түүврийн эрэлт бага, 10 хүртэлх нүдийг турших боломжтой.
■ Өндөр нэвтрүүлэх чадвар: 384, 96, 24, 12, 6 цооногийн ялтсуудад өсгөвөрлөсөн эсүүдийн РНХ-ийг хурдан илрүүлдэг.
■ ДНХ баллуур нь суллагдсан геномыг хурдан устгаж, дараагийн туршилтын үр дүнд үзүүлэх нөлөөллийг эрс багасгадаг.
■ Оновчтой RT ба qPCR систем нь хоёр үе шаттай RT-PCR урвуу транскрипцийг илүү үр дүнтэй, ПГУ-ыг илүү тодорхой болгож, RT-qPCR урвалын дарангуйлагчдад илүү тэсвэртэй болгодог.
Иж бүрдэл програм
Хэрэглэх хүрээ: өсгөвөрлөсөн эсүүд.
- Дээж задралаар ялгарсан РНХ: зөвхөн энэ багцын RT-qPCR загварт хамаарна.
- Энэхүү иж бүрдлийг дараах зорилгоор ашиглаж болно: генийн экспрессийн шинжилгээ, siRNA-аар дамжсан генийг намжаах нөлөөг шалгах, эмийн скрининг гэх мэт.
Диаграм
Хадгалалт ба Хадгалах хугацаа
Энэ багцын I хэсгийг 4℃ хэмд хадгалах ёстой;II хэсгийг -20 хэмд хадгална.
Foregene Protease Plus II-ийг 4 хэмд хадгална℃, -20℃ хэмд хөлдөөж болохгүй.
Урвалж 2×Шууд qPCR Mix-SYBR-ийг -20 хэмд хадгална℃харанхуйд;байнга хэрэглэдэг бол 4-т ч бас хадгалж болно℃ богино хугацаанд хадгалах (10 хоногийн дотор ашиглах).
Бодит цагийн ПГУ-ын праймерын дизайны зарчим
Урагшаа праймер ба урвуу праймер
Бодит цагийн ПГУ-ын хувьд праймер дизайн маш чухал юм.Праймерууд нь ПГУ-ын олшруулалтын өвөрмөц байдал, үр дүнтэй холбоотой бөгөөд дараах зарчмуудыг үндэслэн боловсруулж болно.
Праймерын урт: 18-30bp.
GC агууламж: 40-60%.
Tm утга: Primer 5 гэх мэт праймер дизайны програм хангамж нь праймерын Tm утгыг өгч чадна.Урсгалын дээд ба доод талын праймеруудын Tm утгууд аль болох ойр байх ёстой.Tm-ийн тооцооллын томъёог мөн ашиглаж болно: Tm = 4 ° C (G + C) + 2 ° C (A + T).ПГУ-ыг хийхдээ праймерын Tm-ээс доош температурыг 5 ° C-аас бага температурыг ерөнхийд нь зөөлрүүлэх температур гэж сонгоно (засварлах температурын харгалзах өсөлт нь ПГУ-ын урвалын өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлдэг).
Праймер ба ПГУ-ын бүтээгдэхүүн:
Дизайн праймер ПГУ-ын олшруулалтын бүтээгдэхүүний урт нь 100-150bp байх нь дээр.
Загварын хоёрдогч бүтцийн хэсэгт дизайны праймераас аль болох зайлсхийх хэрэгтэй.
Урсгалын дээд ба доод талын праймеруудын 3′ төгсгөлийн хооронд 2 ба түүнээс дээш нэмэлт суурь үүсэхээс зайлсхий.
Праймер 3′ терминалын суурь нь нэмэлт 3 дараалсан G эсвэл C-тэй байж болохгүй.
Праймерууд өөрсдөө нэмэлт бүтэцтэй байж болохгүй, эс тэгвээс үсний хавчаар бүтэц үүсч, ПГУ-ын олшруулалтад нөлөөлнө.
ATCG-ийг праймерын дарааллаар аль болох жигд тарааж, 3′ терминалын суурийг T гэж үзэхээс зайлсхийх хэрэгтэй.
Хавсралт 1: Cell Direct RT-qPCR Kit бүрэлдэхүүн хэсгийн нэмэлт багц
1.Эсийн задралын уусмал
|
| |||
| Иж бүрдэл хэсгүүд (24 худгийн задралын систем / худаг) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 Т | 500 Т | ||
| ХэсэгI | Буфер CL | 20 мл | 100 мл |
| Foregene Protease Plus II | 400 мкл | 1 мл × 2 | |
| буфер ST | 1 мл × 2 | 10 мл | |
| ХэсэгII | ДНХ баллуур | 400 мкл | 1 мл × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Иж бүрдэл хэсгүүд (20 мкл урвалын систем) | DRT-01011-B1 |
| 200 Т | |
| 5 × Шууд RT Mix | 800 мкл |
| RNase-гүй ddH2O | 1.7 мл × 2 |
|
| ||
| Иж бүрдэл хэсгүүд (20 мкл урвалын систем) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 Т | 1000 Т | |
| 2× Шууд qPCR Mix-SYBR | 1 мл × 2 | 1.7 мл × 6 |
| 50 × ROX лавлагаа будаг | 40 мкл | 200 мкл |
| RNase-гүй ddH2O | 1.7 мл | 10 мл |
Зааварчилгааны гарын авлага:
