RT-qPCR нь энгийн ПГУ-ын технологиос боловсруулагдсан.Энэ нь уламжлалт ПГУ-ын урвалын системд флюресцент химийн бодисуудыг (флюресцент будагч бодис эсвэл флюресцент датчик) нэмж, өөр өөр гэрэлтүүлэгч механизмын дагуу ПГУ-ын задлах, сунгах үйл явцыг бодит цаг хугацаанд илрүүлдэг.ПГУ-ын мөчлөг бүрт бүтээгдэхүүний өөрчлөлтийн хэмжээг тооцоолохын тулд орчин дахь флюресцент дохионы өөрчлөлтийг ашигладаг.Одоогийн байдлаар хамгийн түгээмэл арга бол флюресцент будах арга, датчик арга юм.

Флюресцент будах арга:
SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO гэх мэт зарим флюресцент будагч бодисууд нь өөрөө гэрэл цацруулдаггүй, харин dsDNA-ийн жижиг ховилтой холбогдсоны дараа флюресцент ялгаруулдаг.Тиймээс ПГУ-ын урвалын эхэн үед машин флюресцент дохиог илрүүлж чадахгүй.Урвал нь анивчих-өргөтгөх (хоёр үе шаттай арга) эсвэл өргөтгөлийн үе шатанд (гурван үе шаттай арга) шилжих үед энэ үед давхар хэлхээ нээгдэж, шинэ ДНХ полимераз Тулгуурын синтезийн явцад флюресцент молекулууд dsDNA-ийн жижиг ховилд нэгдэж, флюресцент ялгаруулдаг.ПГУ-ын мөчлөгийн тоо нэмэгдэхийн хэрээр илүү олон будагч бодисууд dsDNA-тай нэгдэж, флюресцент дохио нь мөн тасралтгүй нэмэгддэг.SYBR Green Ⅰ-г жишээ болгон ав.
Шинжилгээний арга:
Такман датчик нь хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг гидролизийн датчик юм.Сорьцын 5′ төгсгөлд флюресцент бүлэг байдаг бөгөөд ихэвчлэн FAM байдаг.Зорилтот ген нь өөрөө нэмэлт дараалал юм.Флюрофорын 3′ төгсгөлд флюресцент унтраах бүлэг байдаг.Флюресценцийн резонансын энергийг шилжүүлэх зарчмын дагуу (Förster resonance energy transfer, FRET) үед сурвалжлагч флюресцент бүлэг (донор флюресцент молекул) ба унтраах флюресцент бүлэг (хүлээн авагч флюресцент молекул) Өдөөлтийн спектр давхцаж, зай нь маш ойрхон (7-10 нм флюресцент молекул) үед. хүлээн авагч молекул, харин автофлуоресценц сулардаг.Тиймээс ПГУ-ын урвалын эхэн үед датчик нь системд чөлөөтэй, бүрэн бүтэн байх үед сурвалжлагч флюресцент бүлэг нь флюресцент ялгаруулдаггүй.Загварлах үед праймер болон датчик нь загварт холбогддог.Сунгах үе шатанд полимераз нь шинэ гинжийг тасралтгүй нэгтгэдэг.ДНХ полимераз нь 5′-3′ экзонуклеазын идэвхжилтэй.Зонд хүрэх үед ДНХ полимераз нь загвараас мэдрэгчийг гидролиз болгож, сурвалжлагч флюресцент бүлгийг унтраагч флюресцент бүлгээс салгаж, флюресцент дохиог гаргана.Сорьц болон загвар хоёрын хооронд ганцаарчилсан хамаарал байдаг тул датчикийн арга нь туршилтын нарийвчлал, мэдрэмжийн хувьд будах аргаас давуу юм.

Зураг 1 qRT-ПГУ-ын зарчим

Праймер дизайн
Зарчмууд:

Праймерууд нь нуклейн хүчлийн цувралын хадгалагдсан бүсэд хийгдсэн байх ёстой бөгөөд өвөрмөц шинж чанартай байх ёстой.

cDNA-ийн дарааллыг ашиглах нь хамгийн сайн арга бөгөөд мРНХ-ийн дарааллыг мөн хүлээн зөвшөөрөх боломжтой.Хэрэв үгүй ​​бол ДНХ-ийн дарааллын cds бүсийн дизайныг олж мэдээрэй.
Флюресцент тоон бүтээгдэхүүний урт нь 80-150bp, хамгийн урт нь 300bp, праймерын урт нь ерөнхийдөө 17-25 баазын хооронд байх ба урсгалын дээд ба доод талын праймеруудын хоорондох ялгаа нь хэтэрхий том байх ёсгүй.

G+C агуулга нь 40%-60%, 45-55% нь хамгийн шилдэг нь.
TM утга нь 58-62 градусын хооронд байна.
Праймер димер ба өөрөө димерээс зайлсхийхийг хичээ, (дараалсан 4 хосоос илүүгүй нэмэлт суурь гарч ирэхгүй) үсний хавчаар бүтэц, хэрэв зайлсхийх боломжгүй бол ΔG<4.5кЖ/моль* болгоно. Хэрэв урвуу транскрипцийн үед gDNA устгагдсан эсэхийг баталгаажуулж чадахгүй бол интроны праймеруудыг загварчлах нь хамгийн сайн арга юм. A/G тасралтгүй бүтэц (2-3) праймер ба бус
тодорхой Нэг төрлийн бус олшруулсан дарааллын гомологи нь 70%-иас бага буюу 8 нэмэлт суурь гомологитой байвал зохимжтой.
Өгөгдлийн сан:
CottonFGD-г түлхүүр үгээр хайх
Праймер дизайн:
IDT-qPCR праймер дизайн

Fig2 IDT онлайн праймер дизайны хэрэгслийн хуудас

Зураг 3 үр дүнгийн хуудасны дэлгэц
lncRNA праймеруудын дизайн:
lncRNA:мРНХ-тэй ижил алхамууд.
миРНХ:Үүдэл гогцооны аргын зарчим: Бүх миРНХ нь 23 nt орчим богино дараалалтай тул ПГУ-ын шууд илрүүлэлт хийх боломжгүй тул ишний давталтын дарааллын хэрэгслийг ашигладаг.Ишний гогцооны дараалал нь 50 н орчим хэмжээтэй нэг судалтай ДНХ бөгөөд энэ нь өөрөө үсний хавчаар бүтэц үүсгэж чаддаг.3 'Төгсгөлийг миРНХ-ийн хэсэгчилсэн фрагментийг нэмэлт дараалал болгон зохион бүтээж, урвуу транскрипцийн үед зорилтот миРНХ-ийг иш-гогцооны дараалалд холбож, нийт урт нь qPCR-ээр тодорхойлсон олшруулсан бүтээгдэхүүний урттай 70bp хүрэх боломжтой.Хаягдлын miRNA праймер дизайн.
Олшруулалтын тусгай илрүүлэлт:
Онлайн тэсэлгээний мэдээллийн сан: CottonFGD тэсэлгээний дарааллын төстэй байдлаар
Local blast: Local blast хийхдээ Blast+-г ашиглана уу, linux болон macos шууд локал мэдээллийн сан үүсгэх боломжтой, win10 системийг мөн ubuntu bash суулгасны дараа хийж болно.Орон нутгийн тэсэлгээний мэдээллийн сан болон орон нутгийн тэсэлгээний сан үүсгэх;win10 дээр ubuntu bash нээх.
Анхаар: Уулын хөвөн ба далайн арлын хөвөн нь тетраплоид үр тариа тул тэсэлгээний үр дүнд ихэвчлэн хоёр ба түүнээс дээш шүдэнз гарах болно.Өмнө нь NAU cd-г мэдээллийн сан болгон ашиглаж тэсэлгээ хийхдээ хэдхэн SNP ялгаа бүхий хоёр гомолог генийг олох боломжтой байсан.Ихэвчлэн хоёр гомолог генийг праймер дизайнаар тусгаарлах боломжгүй тул тэдгээрийг ижилхэн гэж үздэг.Хэрэв илэрхий indel байгаа бол праймерыг ихэвчлэн индель дээр хийдэг боловч энэ нь праймерын хоёрдогч бүтцэд хүргэж болзошгүй Чөлөөт энерги нэмэгдэж, олшруулалтын үр ашиг буурахад хүргэдэг, гэхдээ энэ нь зайлшгүй юм.

Праймер хоёрдогч бүтцийг илрүүлэх:
Алхам:олиго 7-г нээх → оролтын загварын дарааллыг хаах → дэд цонхыг хаах → хадгалах → загвар дээр праймерыг олох, праймерын уртыг тохируулахын тулд ctrl+D дарна уу → өөрөө димержих их бие, гетеродимер, үсний хавчаар, таарахгүй гэх мэт төрөл бүрийн хоёрдогч бүтцэд дүн шинжилгээ хийнэ. 4-р зураг дээрх сүүлийн хоёр зураг нь праймерын туршилтын үр дүн юм.Урд талын праймерын үр дүн сайн, тодорхой димер ба үсний хавчаар бүтэц байхгүй, тасралтгүй нэмэлт суурь байхгүй, чөлөөт энергийн үнэмлэхүй утга нь 4.5-аас бага, харин арын праймер тасралтгүй харуулж байна 6 суурь нь нэмэлт, чөлөөт энерги нь 8.8;үүнээс гадна 3′ төгсгөлд илүү ноцтой димер гарч ирэх ба дараалсан 4 суурийн димер гарч ирнэ.Хэдийгээр чөлөөт энерги өндөр биш ч 3′ dimer Chl нь олшруулах өвөрмөц чанар болон олшруулалтын үр ашигт ноцтой нөлөөлдөг.Үүнээс гадна үсний хавчаар, гетеродимер, тохирохгүй байгаа эсэхийг шалгах шаардлагатай.

Fig3 oligo7 илрүүлэх үр дүн
Олшруулалтын үр ашгийг илрүүлэх:
ПГУ-ын урвалын олшруулалтын үр ашиг нь ПГУ-ын үр дүнд ноцтой нөлөөлдөг.Мөн qRT-PCR-д олшруулалтын үр ашиг нь тоон үр дүнд онцгой чухал байдаг.Урвалын буферт байгаа бусад бодис, машин, протоколуудыг устгана уу.Праймеруудын чанар нь qRT-PCR-ийн олшруулалтын үр ашигт ихээхэн нөлөөлдөг.Үр дүнгийн нарийвчлалыг хангахын тулд харьцангуй флюресценцийн хэмжигдэхүүн ба үнэмлэхүй флюресценцийн хэмжигдэхүүн аль аль нь праймеруудын олшруулах үр ашгийг илрүүлэх шаардлагатай.qRT-ПГУ-ын үр дүнтэй олшруулалтын үр ашиг нь 85% -аас 115% хооронд байдаг гэдгийг хүлээн зөвшөөрсөн.Хоёр арга байдаг:
1. Стандарт муруй арга:
а.cDNA холино
б.Градиент шингэрүүлэлт
c.qPCR
г.Олшруулах үр ашгийг тооцоолох шугаман регрессийн тэгшитгэл
2. LinRegPCR
LinRegPCR нь бодит цагийн RT-PCR өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх програм бөгөөд үүнийг SYBR Green эсвэл ижил төстэй химийн бодис дээр суурилсан тоон ПГУ (qPCR) гэж нэрлэдэг.Хөтөлбөр нь суурь бус залруулгатай өгөгдлийг ашиглаж, дээж тус бүр дээр суурь засварыг тусад нь хийж, шугаман байдлын цонхыг тодорхойлж, дараа нь ПГУ-ын өгөгдлийн багцаар шулуун шугамыг тохируулахын тулд шугаман регрессийн шинжилгээг ашигладаг.Энэ шугамын налуугаас дээж бүрийн ПГУ-ын үр ашгийг тооцоолно.Ампликон ногдох ПГУ-ын дундаж үр ашиг болон дээжинд ногдох Ct утгыг дурын флюресценцийн нэгжээр илэрхийлсэн дээжинд ногдох анхны концентрацийг тооцоолоход ашигладаг.Өгөгдлийн оролт, гаралт нь Excel хүснэгтээр дамждаг.Зөвхөн дээж
холих шаардлагатай, градиент байхгүй
алхмууд шаардлагатай:(Жишээ нь Bole CFX96-г авч үзье, ABI нь тодорхой машин биш)
туршилт:Энэ нь стандарт qPCR туршилт юм.
qPCR өгөгдлийн гаралт:LinRegPCR нь гаралтын файлын хоёр хэлбэрийг таних боломжтой: RDML эсвэл тоон үзүүлэлт Олшруулах үр дүн.Үнэн хэрэгтээ энэ нь циклийн дугаар ба флюресценцийн дохионы бодит цагийн илрүүлэх утга бөгөөд олшруулалтыг шугаман сегментийн үр ашгийн флюресценцийн өөрчлөлтийн утгыг шинжлэх замаар олж авдаг.
Өгөгдлийн сонголт: Онолын хувьд RDML утгыг ашиглах боломжтой байх ёстой.Миний компьютерийн асуудал бол програм хангамж RDML-ийг таньж чадахгүй байгаа учраас би excel-ийн гаралтын утгыг анхны өгөгдөл болгон авч байна.Дээж нэмэхгүй байх гэх мэт мэдээллийг эхлээд бүдүүлэг скрининг хийхийг зөвлөж байна. Гаралтын өгөгдлийн цэгүүдийг устгаж болно (мэдээжийн хэрэг, та тэдгээрийг устгах боломжгүй, LinRegPCR дараагийн шатанд эдгээр цэгүүдийг үл тоомсорлох болно)

Зураг 5 qPCR өгөгдлийн экспорт

Зураг 6 нэр дэвшигчийн дээжийг сонгох

Өгөгдлийн оролт:Мэргэшлийн олшруулалтын үр дүнг нээнэ үү.xls, → LinRegPCR-г нээ → файлыг → excel-ээс унш → Зураг 7-д үзүүлсэн шиг параметрүүдийг сонгоно → OK → суурь үзүүлэлтийг тодорхойлох дээр дарна уу.

linRegPCR өгөгдөл оруулах 7 алхам

Үр дүн:Хэрэв давталт байхгүй бол бүлэглэх шаардлагагүй.Хэрэв давталт байгаа бол бүлэглэлийг дээжийн бүлэгт засварлаж болох бөгөөд генийн нэрийг танигч хэсэгт оруулаад дараа нь ижил ген автоматаар бүлэглэгдэх болно.Эцэст нь файл дээр дарж, excel-г экспортлоод үр дүнг харна уу.Худаг бүрийн өсгөлтийн үр ашиг болон R2 үр дүнг харуулах болно.Хоёрдугаарт, хэрэв та бүлгүүдэд хуваах юм бол залруулсан дундаж өсгөлтийн үр ашгийг харуулах болно.Праймер бүрийн олшруулалтын үр ашиг 85% -аас 115% хооронд байгаа эсэхийг шалгаарай.Хэрэв энэ нь хэтэрхий том эсвэл хэтэрхий жижиг бол энэ нь праймерын олшруулах үр ашиг муу байна гэсэн үг юм.

Зураг 8 Үр дүн ба өгөгдлийн гаралт

Туршилтын үйл явц:
РНХ-ийн чанарын шаардлага:
Цэвэр байдал:1.72.0 нь изотиоцианатын үлдэгдэл байж болохыг харуулж байна.Цэвэр нуклейн хүчил A260/A230 нь 2 орчим байх ёстой.Хэрэв 230 нм-т хүчтэй шингээлттэй байвал фенатын ион зэрэг органик нэгдлүүд байгааг илтгэнэ.Үүнээс гадна 1.5% агароз гель электрофорезоор илрүүлж болно.ssRNA-д денатураци байхгүй, молекул жингийн логарифм нь шугаман хамааралгүй, молекулын жинг зөв илэрхийлэх боломжгүй тул маркерыг чиглүүл.Төвлөрөл: Онолын хувьдүгүй100нг/ул-аас бага, хэрэв концентраци хэт бага бол цэвэршилт нь ерөнхийдөө өндөр биш бага байна

Зураг 9 РНХ гель

Түүнчлэн хэрэв дээж нь үнэ цэнэтэй, РНХ-ийн концентраци өндөр байвал задлан авсны дараа хэсэгчлэн авч, урвуу транскрипц хийх зорилгоор РНХ-ийг 100-300 нг/ул эцсийн концентрацид шингэлнэ.ондурвуу транскрипцийн үйл явц, мРНХ-г хөрвүүлэх үед урвуу транскрипцид зориулж полиА сүүлтэй тусгайлан холбогдож чаддаг олиго (dt) праймеруудыг ашигладаг бол lncRNA болон circRNA нь нийт РНХ-ийн урвуу транскрипцид зориулж санамсаргүй гексамер (санамсаргүй 6 мер) праймеруудыг miRNA-д зориулж, миРНХ-ийн өвөрмөц рескрипт-транкриптийн праймеруудыг ашигладаг.Одоо олон компани хаягдлын тусгай иж бүрдэл үйлдвэрлэж эхэлсэн.Үүдэл гогцооны аргын хувьд хаягдлын арга нь илүү тохиромжтой, өндөр бүтээмжтэй, урвалж хэмнэдэг боловч нэг гэр бүлийн миРНХ-ийг ялгах үр нөлөө нь ишний гогцооны аргын адил сайн байх ёсгүй.Урвуу транскрипцийн иж бүрдэл бүр нь генийн өвөрмөц праймеруудын (ишний гогцоо) концентрацид тавигдах шаардлагыг тавьдаг.МиРНХ-д ашигладаг дотоод лавлагаа нь U6 юм.Ишний гогцоог урвуу оруулах явцад U6-ийн хоолойг тусад нь эргүүлж, U6-ийн урд болон хойд праймеруудыг шууд нэмнэ.circRNA болон lncRNA хоёулаа HKGs-ийг дотоод лавлагаа болгон ашиглаж болно.ондcDNA илрүүлэх,
Хэрэв РНХ-тэй холбоотой асуудал байхгүй бол cDNA бас хэвийн байх ёстой.Гэсэн хэдий ч, хэрэв туршилтыг төгс төгөлдөр болгохын тулд гДНХ-ийг CD-ээс ялгаж чадах дотоод лавлагаа генийг (Reference gen, RG) ашиглах нь хамгийн сайн арга юм.Ерөнхийдөө RG бол гэрийн үйлчлэгч ген юм., HKG) 10-р зурагт үзүүлсний дагуу;Тэр үед би шар буурцгийн агуулах уураг хийж байсан бөгөөд дотоод лавлагаа болгон интрон агуулсан актин7 ашигласан.Энэ праймерын гДНХ дэх олшруулсан фрагментийн хэмжээ 452bp байсан ба хэрэв cDNA-г загвар болгон ашигласан бол 142bp байсан.Дараа нь шинжилгээний үр дүн нь cDNA-ийн нэг хэсэг нь гДНХ-ээр үнэхээр бохирдсон болохыг олж мэдсэн бөгөөд урвуу транскрипцийн үр дүнд ямар ч асуудал гараагүй бөгөөд үүнийг ПГУ-ын загвар болгон ашиглаж болно.Агароз гель электрофорезыг cDNA-тай шууд явуулах нь ашиггүй бөгөөд энэ нь сарнисан тууз бөгөөд энэ нь үнэмшилтэй биш юм.

Зураг 10 cDNA илрүүлэх

qPCR нөхцөлийг тодорхойлохерөнхийдөө tm утгын алхамд иж бүрдэлийн протоколын дагуу асуудалгүй.Хэрэв праймерын дизайн хийх явцад зарим праймерыг сайн төлөвлөөгүй бөгөөд үүний үр дүнд tm-ийн утга ба онолын 60°C-ийн хооронд их зөрүү гарч байвал cDNA-г дээжийг хольсны дараа праймераар градиент ПГУ-ыг ажиллуулж, температурыг TM утга болгон туузгүй болгохоос зайлсхийхийг зөвлөж байна.

Мэдээллийн дүн шинжилгээ хийх

Уламжлалт харьцангуй флюресценцийн тоон ПГУ-ын боловсруулах арга нь үндсэндээ 2-т нийцдэг-ΔΔCT.Мэдээлэл боловсруулах загвар.

Холбоотой бүтээгдэхүүн:

Бодит цагийн ПГУ хялбар^TM - Такман

Бодит цагийн ПГУ хялбар^TM -СИБР ГРИН I

RT Easy I (Эхний хэлхээний cDNA синтезийн мастер премикс)

RT Easy II (qPCR-д зориулсан эхний хэлхээний cDNA синтезийн мастер премикс)