Флюресценцийн тоон ПГУ (мөн TaqMan ПГУ, цаашид FQ-PCR гэх) нь 1995 онд АНУ-д PE (Перкин Элмер)-ийн боловсруулсан нуклейн хүчлийн тоон үзүүлэлтийн шинэ технологи юм. Энэхүү технологи нь флюресцент шошготой датчикуудыг нэмж ердийн ПГУ-д суурилдаг.Уян хатан ПГУ-тай харьцуулахад FQ-ПГУ нь тоон функцээ хэрэгжүүлэх олон давуу талтай.Энэхүү нийтлэл нь технологийн онцлог, зарчим, арга, хэрэглээг товч тайлбарлахыг зорьсон.
1 Онцлогууд
FQ-PCR нь энгийн ПГУ-ын өндөр мэдрэмжтэй төдийгүй флюресцент датчикийг ашигладаг тул фотоэлектрик дамжуулалтын системээр дамжуулан ПГУ-ын олшруулалтын явцад флюресцент дохионы өөрчлөлтийг шууд илрүүлж тоон үр дүнд хүрэх боломжтой бөгөөд энэ нь уламжлалт ПГУ-ын олон дутагдлыг даван туулж, ДНХ-ийн өндөр нарийвчлалтай, өндөр hycubracic технологитой байдаг.
Жишээлбэл, ерөнхий ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг агароз гель электрофорез ба этилийн бромидын хэт ягаан туяагаар будах эсвэл полиакриламид гель электрофорез, мөнгөн будгаар будах замаар ажиглах шаардлагатай.Энэ нь зөвхөн олон хэрэгсэл шаарддаг төдийгүй цаг хугацаа, хүчин чармайлт шаарддаг.Этидиум бромидыг ашигласан толбо нь хүний биед хортой бөгөөд эдгээр нарийн төвөгтэй туршилтын процедур нь бохирдол, хуурамч эерэг үр дүнг өгдөг.Гэсэн хэдий ч, FQ-PCR нь дээжийг ачаалах үед тагийг нь зөвхөн нэг удаа онгойлгох шаардлагатай бөгөөд дараагийн процесс нь ПГУ-ын дараах боловсруулалтыг шаарддаггүй бүрэн хаалттай хоолойтой ажиллагаа бөгөөд уламжлалт ПГУ-ын үйл ажиллагаанд олон дутагдалтай талуудаас зайлсхийдэг.Туршилтанд ерөнхийдөө PE компанийн боловсруулсан ABI7100 ПГУ-ын дулааны циклийг ашигладаг.
Энэхүү багаж нь дараах шинж чанаруудтай: ① Өргөн хэрэглээ: ДНХ, РНХ-ийн ПГУ-ын бүтээгдэхүүний тоон үзүүлэлт, генийн экспрессийн судалгаа, эмгэг төрүүлэгчийг илрүүлэх, ПГУ-ын нөхцлийг оновчтой болгоход ашиглаж болно.② Өвөрмөц тоон зарчим: Флюресцентээр шошготой датчикийг ашиглан флюресценцийн хэмжээ нь лазерын өдөөлтийн дараа ПГУ-ын циклд хуримтлагдаж, тоон үзүүлэлтийн зорилгод хүрэх болно.③ Ажлын өндөр үр ашиг: 9600 ПГУ-ын дулааны мөчлөгт суурилуулсан, 96 дээжийг автоматаар болон синхроноор олшруулж, тоон тогтоохын тулд 1-2 цагийн компьютерийн хяналттай.④ Гель электрофорез хийх шаардлагагүй: Дээжийг шингэлж электрофорез хийх шаардлагагүй, зөвхөн тусгай датчик ашиглан урвалын хоолойд шууд илрүүлнэ.⑤ Дамжуулах хоолойд ямар ч бохирдол байхгүй: Өвөрмөц бүрэн хаалттай урвалын хоолой ба фотоэлектрик дамжуулах системийг нэвтрүүлсэн тул бохирдлын талаар санаа зовох шаардлагагүй болно.⑥Үр дүн нь дахин давтагдах боломжтой: тоон динамик муж нь таван шатлал хүртэл байна.Тиймээс энэхүү технологийг амжилттай хөгжүүлснээс хойш олон шинжлэх ухааны судлаачид үнэлэгдэж, олон салбарт хэрэглэгдэж ирсэн.
2 Зарчим ба арга
FQ-ПГУ-ын ажиллах зарчим нь ПГУ-ын урвалын системд флюресцентээр тэмдэглэсэн датчик нэмэхийн тулд Taq ферментийн 5′→3′ экзонуклеазын идэвхийг ашиглах явдал юм.Проб нь праймерын дараалалд агуулагдах ДНХ загвартай тусгайлан эрлийзждэг.Сорьцын 5′ төгсгөлд флюресценцийн ялгаралтын ген FAM (6-карбоксифлуоресцеин, флюресценцийн ялгаралтын оргил 518 нм), 3′ төгсгөлд флюресценц унтраах бүлэг TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, флюресценц 28 нм) гэсэн шошготой байна. ПГУ-ын олшруулалтын үед датчикийг сунгахаас сэргийлж фосфоржуулсан.Сорьц бүрэн бүтэн байх үед унтраах бүлэг нь ялгаруулагч бүлгийн флюресценцийн ялгаралтыг дардаг.Ялгаруулагч бүлгийг бөхөөх бүлгээс салгасны дараа дарангуйлал арилж, 518 нм-ийн оптик нягтрал нэмэгдэж, флюресценц илрүүлэх системээр илрүүлдэг. Сэргээх үе шатанд датчик нь загвар ДНХ-тэй эрлийзждэг ба өргөтгөлийн үе дэх Taq фермент нь ДНХ-ийн температурын өргөтгөлтэй хамт хөдөлдөг.Сорьцыг таслахад унтрах нөлөө гарч, флюресцент дохио гардаг.Загварыг хуулах болгонд флюресцент дохионы хамт датчик таслагдана.Суллагдсан флуорофорын тоо болон ПГУ-ын бүтээгдэхүүний тоо хоёрын хооронд нэгээс нэг хамаарал байдаг тул энэ аргыг ашиглан загварыг зөв тооцоолох боломжтой.Туршилтын хэрэгсэл нь ерөнхийдөө PE компанийн бүтээсэн ABI7100 ПГУ-ын дулааны циклийг ашигладаг бөгөөд бусад дулааны циклийг ашиглаж болно.Хэрэв туршилтанд ABI7700 урвалын төрлийн урвалын системийг ашигласан бол урвал дууссаны дараа тоон үр дүнг компьютерийн шинжилгээгээр шууд гаргаж болно.Хэрэв та бусад дулааны циклер ашигладаг бол RQ+, RQ-, △RQ-ийг тооцоолохын тулд урвалын хоолой дахь флюресценцийн дохиог нэгэн зэрэг хэмжихийн тулд флюресценцийн мэдрэгч ашиглах хэрэгтэй.RQ+ нь дээжийн хоолойн флюресцент ялгаралтын бүлгийн гэрэлтэлтийн эрчмийг бөхөөх бүлгийн гэрэлтэлтийн эрчмтэй харьцуулсан харьцааг, RQ- хоосон хоолой дахь хоёрын харьцааг, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) нь флюресцентийн процессын явцад олж авсан өгөгдлийн хэмжээ, Флюресцентийн үр дүнгийн өөрчлөлтийг илэрхийлнэ.Флюресцент датчикийг нэвтрүүлснээр туршилтын өвөрмөц байдал мэдэгдэхүйц сайжирсан.Сорьцын загвар нь ерөнхийдөө дараах нөхцлүүдийг хангасан байх ёстой: ①Холбооны өвөрмөц байдлыг хангахын тулд датчикийн урт нь ойролцоогоор 20-40 суурьтай байх ёстой.②Ганц нуклеотидын дарааллыг давтахаас зайлсхийхийн тулд GC суурийн агууламж 40% -аас 60% хооронд байна.③ Эрлийзжих, праймертай давхцахаас зайлсхий.④ Сорьц ба загвар хоорондын холболтын тогтвортой байдал нь праймер ба загвар хоорондын холболтын тогтвортой байдлаас их байдаг тул датчикийн Tm утга нь праймерын Tm утгаас дор хаяж 5°С өндөр байх ёстой.Нэмж дурдахад датчикийн концентраци, датчик ба загварын дарааллын хоорондох ижил төстэй байдал, датчик ба праймер хоорондын зай зэрэг нь туршилтын үр дүнд нөлөөлдөг.
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
Хятад бодит цагийн ПГУ Easyᵀᴹ-Taqman үйлдвэрлэгч ба нийлүүлэгч |Foregene (foreivd.com)
Шуудангийн цаг: 2021 оны 10-р сарын 15
