RT-qPCR туршилт нь РНХ-ийн олборлолт, чанарын үнэлгээ, урвуу транскрипц, qPCR гэсэн гурван үе шатыг багтаасан бөгөөд алхам бүр нь маш олон урьдчилан сэргийлэх арга хэмжээг агуулдаг бөгөөд бид доор дэлгэрэнгүй танилцуулах болно.

Ⅰ.РНХ-ийн чанарын үнэлгээ

RT-qPCR туршилтанд РНХ-ийн олборлолт дууссаны дараа РНХ-ийн чанарыг үнэлэх шаардлагатай бөгөөд дараагийн туршилтыг зөвхөн шаардлага хангасны дараа хийж болно.Үнэлгээний аргууд нь спектрофотометр, Agilent гель электрофорез, Agilent 2100 шинжилгээ зэрэг багтдаг бөгөөд эдгээрээс хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг спектрофотометр, агароз гель электрофорезийн аргыг илрүүлэх арга юм.РНХ-ийн чанарыг баталгаажуулахын тулд РНХ-ийн концентраци, цэвэршилт, бүрэн бүтэн байдлыг илрүүлэх, шинжлэхэд эдгээр хоёр аргыг хамтад нь ашиглах шаардлагатай гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

Холбогдох РНХ тусгаарлах хэрэгсэл: 

Эсийн нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Төрөл бүрийн өсгөвөрлөсөн эсээс 11 минутын дотор өндөр цэвэршүүлсэн, өндөр чанартай нийт РНХ авах боломжтой.

Амьтны нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Төрөл бүрийн амьтны эд эсээс өндөр цэвэршилттэй, өндөр чанартай нийт РНХ-ийг хурдан бөгөөд үр дүнтэй гаргаж авна.

Спектрофотометр:

Спектрофотометр нь РНХ-ийн концентраци, цэвэршилтийг тодорхойлоход голчлон ашиглагддаг боловч РНХ болон геномын үлдэгдлийн бүрэн бүтэн байдлыг илрүүлж чадахгүй.Тэдгээрийн дотроос A260/280 ба A260/230 нь РНХ-ийн цэвэршилтийг илрүүлэх чухал үзүүлэлтүүд бөгөөд РНХ-ийн цэвэршилтийг тэдгээрийн утгын хэлбэлзлээс хамаарч илрүүлж болно.

1. 1.9< A260/280< 2.1, РНХ-ийн цэвэршилт сайн байгааг илтгэнэ;A260/280<1.9, РНХ-д уургийн үлдэгдэл байж болохыг харуулж байна;A260/280>2.1 нь РНХ-ийн хэсэгчилсэн задралыг харуулж байгаа бөгөөд үүнийг агароз гель электрофорезоор баталгаажуулах боломжтой.

2. 2.0< A260/230< 2.2, РНХ-ийн цэвэршилт сайн байгааг илтгэнэ;A260/230< 2.0 нь РНХ-д фенол, этанол эсвэл сахар зэрэг органик урвалжуудын үлдэгдэл байж болохыг харуулж байна.

Агароз гель электрофорез:

Агароз гель электрофорезийн шинжилгээ нь РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал, геном болон уургийн үлдэгдэлд дүн шинжилгээ хийх боломжтой боловч РНХ-ийн концентрацийг нарийн тодорхойлох эсвэл органик урвалжуудын үлдэгдлийг илрүүлэх боломжгүй юм.Жишээлбэл, эукариот РНХ-ийн загваруудыг авч үзье.

1. РНХ-д агароз гель электрофорез хийсэн.Хэрэв гель зураг дээр 28sRNA, 18sRNA, 5.8sRNA гэсэн гурван дан зурвас байсан бол энэ нь олборлосон РНХ бүрэн бүтэн байгааг илтгэнэ.Хэрэв чирэх үзэгдэл байгаа бол энэ нь РНХ-ийн хэсэгчилсэн задралыг илтгэнэ.

2. Цавууны нүх ба 28sRNA хамтлагийн хооронд ганц тод тууз байвал геномын ДНХ-ийн үлдэгдэл байж болно.

3. Хэрэв цавууны нүхэнд тууз гарч ирвэл энэ нь уураг болон бусад макромолекулын бодисын үлдэгдэл байж болохыг харуулж байна.

Ⅱ. Урвуу хуулбар

РНХ-ийн олборлолт дууссаны дараа түүнийг дараагийн туршилтуудад зориулж cDNA болгон хувиргах шаардлагатай тул буцаах алхам зайлшгүй шаардлагатай.Урвуу транскриптаз ба праймерын сонголтоос урвуу транскрипцийг нэвтрүүлнэ.

Урвуу транскриптазын сонголт:

Ердийн урвуу транскриптазуудад AMV RTase болон MMLV RTase орно.AMV RTase-ийн RNase H нь хүчтэй идэвхжил, богино синтезийн урт, бага синтезийн хэмжээ, дулааны тогтвортой байдал (42 ~ 55 ℃) юм.MMLV RTase-ийн RNase H идэвхжил сул, синтезийн үргэлжлэх хугацаа урт, синтезийн хэмжээ өндөр, дулааны тогтвортой байдал муу (37 ~ 42 ℃).

RNase H фермент нь РНХ-ийн загварыг задлах үүрэгтэй тул урвуу транскрипцийн үед сул RNase H идэвхжилтэй MMLV-ийг сонгох нь зүйтэй бөгөөд хожим генийн инженерчлэл хийсний дараа MMLV-ийн дулааны тогтвортой байдал нь чанарын үсрэлт болсон.Foregene-г авч байнаУрвуу транскриптаза (урвуу транскрипцийн хувьд M-MLV) Жишээ нь, энэ нь генетикийн рекомбинацын технологийг ашиглан E. coli-ийн боловсруулсан бактериудад илэрхийлэгдсэн шинэ урвуу транскриптаза юм.Энэ нь нэг судалтай РНХ, ДНХ эсвэл РНХ:ДНХ эрлийзээс нэмэлт ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлдэг рекомбинант ДНХ полимераз юм.Энэ нь RNase H-ийн идэвхжилгүй, хүчтэй тогтвортой байдал, хүчтэй РНХ-тэй холбоотой, илрүүлэх өндөр мэдрэмжтэй.

 

Урвуу транскриптаза (урвуу транскрипцийн хувьд M-MLV)

Праймерын сонголт:

Ерөнхийдөө RT праймерууд нь олиго dT, санамсаргүй праймер, генийн өвөрмөц праймер гэсэн гурван ангилалд хуваагддаг.Туршилтын янз бүрийн шаардлагын дагуу хэрэглэхэд тохиромжтой праймерыг сонго.

1. Хэрэв загвар нь эукариот гаралтай бөгөөд хожуу cDNA-г ердийн ПГУ-ын олшруулалтад ашигладаг бол Олиго (dT) хийхийг зөвлөж байна;Хэрэв дараагийн туршилтыг зөвхөн qPCR-д ашигладаг бол урвуу транскрипцийн үр ашгийг дээшлүүлэхийн тулд Oligo (dT) -ийг санамсаргүй праймеруудтай холихыг зөвлөж байна.

2. Хэрэв загвар нь прокариотуудаас гаралтай бол урвуу транскрипцид зориулж санамсаргүй праймерууд эсвэл генийн өвөрмөц праймеруудыг сонгоно.

Ⅲ.qPCR

Флюресценцийн хэмжилтийг голчлон тоон аргуудын сонголт, праймерын дизайны зарчим, ROX сонголт, урвалын системийн тохиргоо, урвалын нөхцлийн тохиргоо гэх мэтээр боловсруулдаг.

Тоон аргуудын сонголт:

Тоон аргуудыг харьцангуй тоон арга, үнэмлэхүй тоон аргууд гэж хуваадаг.Харьцангуй тоон үзүүлэлтийг ашиглан тодорхой эмчилгээний аргуудын генийн илэрхийлэлд үзүүлэх нөлөөг илрүүлэх, генийн илэрхийлэлийн ялгааг өөр өөр цаг үед илрүүлэх, өөр өөр эдэд генийн илэрхийллийн ялгааг харьцуулах боломжтой.Үнэмлэхүй хэмжигдэхүүн нь вирүс дэх нуклейн хүчлийн хэмжээг тодорхойлох гэх мэт.Туршилт хийхдээ бид өөрсдийн туршилтын дагуу зохих тоон аргыг сонгох ёстой.

Праймер дизайны зарчим:

qPCR-д зориулсан праймерын загвар нь олшруулалтын үр ашиг, бүтээгдэхүүний онцлогоос шууд хамаардаг.Тиймээс сайн праймерыг зөв зохион бүтээх нь амжилттай qPCR-ийн эхний алхам юм.Праймерын дизайны хувьд ердийн праймер дизайны зарчмыг хангахын тулд дараахь зарчмуудыг анхаарч үзэх хэрэгтэй.

1. Зорилтот фрагментийн уртыг 100-аас 300 bp хооронд хянадаг;

2. Геномын ДНХ-ийн нөлөөллөөс зайлсхийхийн тулд хөндлөн эксон дизайн;

3. Зохион бүтээгдсэн праймеруудыг олшруулалтын үр ашгийг шалгах шаардлагатай бөгөөд зөвхөн олшруулалтын үр ашиг нь стандартад (90-110%) хүрсэн тохиолдолд тэдгээрийг тоон туршилтад ашиглаж болно;

4. Праймерын концентрацийг ихэвчлэн 0.1uM болон 1.0uM хооронд оновчтой болгодог.

СонголтROX:

Тоон урвалын явцад ROX нь ууршилт ба конденсацаас үүссэн оптик замын зөрүү, пиптингийн алдаа эсвэл эзэлхүүний зөрүүг жигд тохируулж, үр дүнгийн давтагдах чадварыг сайжруулдаг.Гэсэн хэдий ч ROX-ийн сонголт нь багажтай холбоотой гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.Хэрэв qPCR хэрэгсэл нь нүхний ялгааг автоматаар засах функцтэй бол ROX нэмэх шаардлагагүй;Үгүй бол ROX залруулга нэмэх шаардлагатай.Урвалж худалдан авах жижиг түншүүд нь зөв ROX-ийг сонгохдоо ашигласан багажийн дагуу байж, дараа нь алдаа гаргахаас зайлсхийх хэрэгтэй.

Урвалын системийг бэлтгэх:

20ul ба 50ul-ийн урвалын эзэлхүүнийг илүүд үздэг.Системийг боловсруулахдаа дараахь зүйлийг анхаарч үзэх хэрэгтэй.

1. Урвалын системийг хэт цэвэр ажлын ширээний агааржуулалтаар бэлтгэх шаардлагатай, шинэ ddH₂O нь туршилт бүрт ашиглагддаг;

2. Туршилт бүр системд бохирдол байгаа эсэхийг шалгахын тулд NTC бэлтгэх шаардлагатай бөгөөд системийг бэлтгэхдээ хос праймер бүр NTC хийх шаардлагатай;

3. РНХ-ийн загварт гДНХ-ийн үлдэгдэл байгаа эсэхийг илрүүлэхийн тулд дээж бүрт NRT бэлдэж илрүүлж болно;

4. Системийг бэлтгэхдээ нэг дээжинд 3-аас доошгүй техникийн давталт хийхийг зөвлөж байна;

5. Загвар нь cDNA байх үед qPCR туршилтанд урвуу транскрипцийн системийн дарангуйлах нөлөөг багасгахын тулд 5-10 дахин шингэлэхийг зөвлөж байна.Загварын хэмжигдэхүүнийг градиентаар судлах нь дээр, ингэснээр CT утга 20-30 хооронд байна;

6. Шаардлагатай тооны урвалыг тодорхойлж, урвалын тоонд үндэслэн 5-10% -иар нэмэгдүүлж, эзлэхүүний тохиргооны дугаарыг тооцоолох;

7, системийг урьдчилан холих зарчмаар бэлтгэж, центрифугийн дараа хольж, бөмбөлөг үүсэхгүй байх;

8, Аль болох туслах материалыг сонгох.

Холбогдох RT-qPCR хэрэгсэл