Пипеткийн үзүүр ба EP хоолойнуудыг ариутгах гэх мэт.
1. 0.1% (мянганы нэг) DEPC (маш хортой бодис)-ыг ионгүйжүүлсэн усаар бэлтгэж, утааны бүрээсэнд болгоомжтой хэрэглэж, гэрлээс хол 40С-т хадгална;
DEPC ус нь DEPC-ээр цэвэршсэн, өндөр температур, өндөр даралтаар ариутгасан цэвэр ус юм.Туршилтаар RNase, DNase, протеиназа агуулаагүй.
2. Пипеткийн үзүүр ба EP хоолойг 0.1% DEPC-д хийж, соруурын үзүүр болон EP хоолойг 0.1% DEP-ээр дүүргэсэн эсэхийг шалгаарай.
3. Гэрлээс хамгаалж, байлгана, хонуулна (12-24 цаг)
4. Үзүүр болон EP хоолойг агуулсан хайрцгийг DEPC-д дэвтээх шаардлагагүй.Үзүүр эсвэл EP хоолой дахь DEPC усыг ойролцоогоор зайлуулсны дараа савлаж, боож өгнө.
5. Цельсийн 121 хэм, 30 мин
6. Цельсийн 180 градус, хэдэн цагийн турш хатаана (дор хаяж 3 цаг)
Жич: a.DEPC-тэй харьцахдаа латекс бээлий, маск өмс!b, эсвэл DEPC ариутгалгүй, 130 ℃, 90 минутын автоклав (олон лабораторид хоёр удаа өндөр температурт ариутгана)
РНХ-ийн олборлолтод анхаарах зүйлс
Эдийн РНХ тусгаарлах дутагдлын хоёр үндсэн үзэгдэл
РНХ-ийн задрал, эд эс дэх хольцын үлдэгдэл,задралын тухайд эхлээд өсгөвөрлөгдсөн эсээс гаргаж авсан РНХ яагаад амархан задрахгүй байгааг харцгаая.Одоо байгаа РНХ ялгах урвалжууд бүгд RNase-ийг хурдан дарангуйлдаг бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг агуулдаг.Өсгөвөрлөсөн эсүүдэд лизат нэмж, зүгээр л холиход бүх эсүүд нь лизаттай сайтар холилдож, эсүүд бүрэн задрах болно.Эсүүд задарсаны дараа лизат дахь идэвхтэй бодисууд нь эсийн доторх RNase-ийг нэн даруй дарангуйлдаг тул РНХ бүрэн бүтэн хэвээр байна.Өөрөөр хэлбэл, өсгөвөрлөсөн эсүүд нь лизаттай амархан бөгөөд бүрэн холбогддог тул РНХ нь амархан мууддаггүй;нөгөө талаас эдэд байгаа эсүүд нь лизаттай хурдан холбоо тогтооход тийм ч хялбар биш учраас эд дэх РНХ амархан задардаг.хангалттай холбоо барихтай холбоотой.Тэгэхээр,Хэрэв РНХ-ийн үйл ажиллагааг дарангуйлж, эдийг нэг эс болгон хувиргах арга байдаг гэж үзвэл задралын асуудлыг бүрэн шийдэж чадна.
Шингэн азотыг тээрэмдэх нь хамгийн үр дүнтэй арга юм.Гэсэн хэдий ч шингэн азотын тээрэмдэх арга нь ялангуяа дээжийн тоо их байх үед маш хэцүү байдаг.Энэ нь дараагийн хамгийн сайн зүйл болох нэгэн төрлийн болгогчийг бий болгосон.Theнэгэн төрлийн болгогчЭнэ арга нь эсүүд лизаттай холбогдохоос өмнө RNase-ийн үйл ажиллагааг хэрхэн дарангуйлдаг вэ гэсэн асуултыг авч үздэггүй, харин эд эсийн эвдрэлийн хурд нь эсийн доторх RNase RN-ийг задлах хурдаас илүү хурдан байхыг залбирдаг.
Цахилгаан гомогенжүүлэгчийн нөлөө илүү сайн,мөн шилэн гомогенжүүлэгчийн нөлөө муу боловч ерөнхийдөө нэгэн төрлийн болгох арга нь доройтлын үзэгдлээс сэргийлж чадахгүй.Тиймээс хэрэв олборлолт нь доройтсон бол шингэн азотоор нунтаглахын тулд анхны цахилгаан гомогенжүүлэгчийг ашиглах шаардлагатай;анхны шилэн гомогенжүүлэгчийг цахилгаан гомогенжүүлэгч болгон өөрчлөх эсвэл шингэн азотоор шууд тээрэмдэх шаардлагатай.Асуудал бараг 100% хэрэгжих боломжтой.шийдэгдэх.
Дараагийн туршилтуудад нөлөөлж буй хольцын үлдэгдэлтэй холбоотой асуудал нь доройтлоос илүү олон янзын шалтгаантай бөгөөд шийдвэрлэх арга замууд нь өөр өөр байдаг.Дүгнэж хэлэхэд,хэрэв эд эсэд эвдрэл, үлдэгдэл хольц байгаа бол тодорхой туршилтын материалын олборлох арга/урвалжийг оновчтой болгох шаардлагатай.Оновчлолын хувьд та үнэт дээжээ ашиглах шаардлагагүй: та захаас загас/тахиа гэх мэт жижиг амьтдыг худалдан авч, РНХ задлах материалын харгалзах хэсгийг авч, нөгөө хэсгийг нь уураг гаргаж авах - ам, ходоод, гэдэсний хандаар нунтаглаж болно.
Олж авсан РНХ-ийн зорилтот РНХ нь өөр өөр дараагийн туршилтуудад ашиглагддаг бөгөөд чанарын шаардлага нь өөр өөр байдаг
cDNA номын сангийн бүтэц нь ферментийн урвал дарангуйлагчийн үлдэгдэлгүй РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг шаарддаг;Хойд нь РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал, ферментийн урвал дарангуйлагчийн үлдэгдэлд бага шаардлага тавьдаг;RT-ПГУ нь хэт өндөр РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг шаарддаггүй.гэхдээ ферментийн урвалыг саатуулдаг.Үлдэгдэлд тавигдах шаардлага хатуу байна.Оролт нь гаралтыг тодорхойлдог;Хамгийн өндөр цэвэршилттэй РНХ-ийг олж авах зорилго тавих бүрт энэ нь хүмүүс болон мөнгөөр хохирох болно.
Дээж цуглуулах/хадгалах
Эвдрэлд нөлөөлөх хүчин зүйлс Дээж амьд бие/эсвэл анхны өсөлтийн орчноос гарсны дараа дээж дэх эндоген ферментүүд РНХ-г задалж эхэлнэ.мөн задралын хурд нь эндоген ферментийн агууламж, температуртай холбоотой байдаг.Уламжлал ёсоор эндоген ферментийн үйл ажиллагааг бүрэн дарангуйлах хоёр л арга байдаг: лизатыг нэн даруй нэмж, сайтар, хурдан нэгэн төрлийн болгох;жижиг хэсэг болгон хувааж, тэр даруй шингэн азотоор хөлдөөх.Хоёр арга хоёулаа хурдан ажиллагаа шаарддаг.Сүүлийнх нь бүх дээжинд тохиромжтой байдаг бол эхнийх нь зөвхөн эс, эндоген ферментийн агууламж багатай, нэгэн төрлийн болгоход хялбар эдэд тохиромжтой.Тодруулбал, ургамлын эд, элэг, бамбай, нойр булчирхай, дэлүү, тархи, өөх тос, булчингийн эдүүд гэх мэтийг үргэлжлүүлэхийн өмнө шингэн азотоор хөлдөөх нь дээр.
Дээжийг хуваах, нэгэн төрлийн болгох
Эвдрэл ба гарцад нөлөөлөх хүчин зүйлс Дээж хуваагдал ньнарийн нэгэн төрлийн болгоход зориулагдсан, энэ нь РНХ-ийг бүрэн, бүрэн гаргахад зориулагдсан.Эсийг задлахгүйгээр шууд нэгэн төрлийн болгох боломжтой.Зөвхөн эвдэрсэний дараа эдийг нэгэн төрлийн болгох боломжтой.Мөөгөнцөр ба бактерийг нэгэн төрлийн болгохын өмнө холбогдох ферментүүдээр задлах шаардлагатай.Эндоген ферментийн агууламж бага, нэгэн төрлийн болгоход хялбар эдийг нэгэн зэрэг буталж, гомогенжүүлэгчээр лизатт нэгэн төрлийн болгох боломжтой;ургамлын эд, элэг, бамбай, нойр булчирхай, дэлүү, тархи, өөх тос, булчингийн эд болон бусад дээж, Эдгээр нь эндоген ферментийн агууламж өндөртэй эсвэл амархан нэгэн төрлийн биш,тиймээс эдийг тасалдуулах, нэгэн төрлийн болгох ажлыг тусад нь хийх ёстой.Хагархай бутлах хамгийн найдвартай, үр дүнтэй арга бол шингэн азотоор тээрэмдэх, нэгэн төрлийн болгох хамгийн найдвартай арга бол цахилгаан нэгэн төрлийнжүүлэгч ашиглах явдал юм.Шингэн азотоор тээрэмдэх тухай онцгой тэмдэглэл: тээрэмдэх явцад дээжийг гэсгээх ёсгүй, учир нь хөлдөөсөн үед эндоген ферментүүд ажиллах магадлал өндөр байдаг.
Лизатын сонголт
Ашиглалтын тав тух болон үлдэгдэл эндоген хольцын хүчин зүйлүүдэд нөлөөлөх Түгээмэл хэрэглэгддэг лизисын уусмалууд нь RNase-ийн үйл ажиллагааг бараг дарангуйлдаг.Тиймээс лизисын уусмалыг сонгох гол зүйл бол цэвэршүүлэх аргатай хослуулан авч үзэх явдал юм.Нэг үл хамаарах зүйл байна:Эндоген ферментийн агууламж өндөртэй дээжүүдэд эндоген ферментийг идэвхгүйжүүлэх чадварыг нэмэгдүүлэхийн тулд фенол агуулсан лизат хэрэглэхийг зөвлөж байна.
Цэвэршүүлэх аргыг сонгох
Эндоген хольцын үлдэгдэлд нөлөөлөх хүчин зүйлс, олборлох хурд Эс зэрэг цэвэр дээжийн хувьд бараг бүх цэвэршүүлэх аргыг хэрэглэснээр хангалттай үр дүнд хүрч чадна.Гэхдээ бусад олон дээж, ялангуяа ургамал, элэг, бактери гэх мэт өндөр хэмжээний хольцтой дээжийн хувьд тохиромжтой цэвэршүүлэх аргыг сонгох нь маш чухал юм.Баганын төвөөс зугтах цэвэршүүлэх арга нь хурдан олборлох хурдтай бөгөөд РНХ-ийн дараагийн ферментийн урвалд нөлөөлдөг хольцыг үр дүнтэй арилгаж чаддаг боловч энэ нь үнэтэй байдаг (Foregene нь хэмнэлттэй иж бүрдэл санал болгож чадна, дэлгэрэнгүй мэдээллийг дарна уу.энд);LiCl хур тунадас зэрэг хэмнэлттэй, сонгодог цэвэршүүлэх аргуудыг ашиглах нь хангалттай үр дүнд хүрэх боломжтой боловч ашиглалтын хугацаа урт байдаг..
РНХ гаргаж авах "Гурван сахилга ба найман анхаарал"
Сахилга бат 1:Экзоген ферментийн бохирдлыг зогсоох.
Тайлбар 1:Маск, бээлий өмсөхийг хатуу чанд сахих.
Тайлбар 2:Туршилтанд хамрагдсан центрифугийн хоолой, үзүүрийн толгой, пипеткийн саваа, электрофорезийн сав, туршилтын вандан сандал зэргийг сайтар хаях хэрэгтэй.
Тайлбар 3:Туршилтанд хамрагдах урвалжууд/уусмалууд, ялангуяа ус нь RNase агуулаагүй байх ёстой.
Сахилга бат 2:Эндоген ферментийн үйл ажиллагааг блоклох
Тайлбар 4:Тохиромжтой нэгэн төрлийн болгох аргыг сонго.
Тайлбар 5:Тохирох лизатыг сонгоно уу.
Тайлбар 6:Дээжний эхлэлийн хэмжээг хянах.
Сахилга бат 3:Олборлох зорилгоо тодорхойл
Тайлбар 7:Аливаа лизат систем нь дээжийн хамгийн их эхлэлийн хэмжээнд ойртоход олборлолтын амжилтын түвшин огцом буурдаг.
Тайлбар 8:РНХ-г амжилттай олборлох эдийн засгийн цорын ганц шалгуур бол гарц биш харин дараагийн туршилтуудын амжилт юм.
RNase-ийн бохирдлын шилдэг 10 эх үүсвэр
1. Хуруу бол экзоген ферментийн анхны эх үүсвэр учраас бээлий өмсөж, байнга сольж байх ёстой.Нэмж дурдахад, амьсгалах нь ферментийн чухал эх үүсвэр болдог тул амны хаалт заавал өмсөх ёстой.Бээлийтэй маск өмсөхийн нэмэлт давуу тал бол туршилт хийж буй хүнийг хамгаалах явдал юм.
2. Пипеткийн үзүүр, центрифугийн хоолой, пипетк – RNase-ыг дангаар нь ариутгах замаар идэвхгүйжүүлэх боломжгүй тул пипеткийн үзүүр болон центрифугийн хоолойг DEPC-ээр эмчилсэн гэж тэмдэглэсэн байсан ч DEPC-ээр эмчилнэ.Тусгай зориулалтын пипеткийг хэрэглэх нь хамгийн сайн арга бөгөөд хэрэглэхийн өмнө 75% спиртийн хөвөн, ялангуяа саваагаар арчих;Үүнээс гадна толгой арилгагч хэрэглэхгүй байхыг анхаарна уу.
3. Ус/буфер нь RNase-ийн бохирдолгүй байх ёстой.
4. Наад зах нь шинжилгээний ширээг 75%-ийн спирттэй хөвөнгээр арчиж цэвэрлэнэ.
5.Эндоген RNase Бүх эдэд эндоген фермент агуулагддаг тул эд эсийг шингэн азотоор хурдан хөлдөөх нь задралыг багасгах хамгийн сайн арга юм.Шингэн азотыг хадгалах/нунтаглах арга нь үнэхээр тохиромжгүй боловч эндоген ферментийн өндөр түвшинтэй эдэд энэ нь цорын ганц арга юм.
6. РНХ-ийн дээж РНХ олборлох бүтээгдэхүүн нь RNase-ийн бохирдлын ул мөр агуулсан байж болно.
7. Плазмидын олборлолт Плазмидын олборлолт нь РНХ-г задлахын тулд ихэвчлэн Rnase-ийг ашигладаг бөгөөд Rnase-ийн үлдэгдэлийг Proteinase K-тай шингээж, PCI-ээр ялган авах хэрэгтэй.
8. РНХ-ийн хадгалалт Бага температурт хадгалагдсан ч гэсэн ул мөр RNase нь РНХ-ийн задралыг үүсгэдэг.РНХ-ийг удаан хугацаагаар хадгалах хамгийн сайн шийдэл бол давс/архины суспенз юм, учир нь архи нь бага температурт бүх ферментийн үйл ажиллагааг саатуулдаг.
9. Катионууд (Ca, Mg) эдгээр ионуудыг агуулсан үед 80С-т 5 минут халаахад РНХ задрахад хүргэдэг тул РНХ-г халаах шаардлагатай бол хадгалах уусмалд хелат үүсгэгч бодис (1мМ натрийн цитрат, рН 6.4) байх шаардлагатай.
10. Дараагийн туршилтуудад ашигласан ферментүүд RNase-ээр бохирдсон байж болно.
РНХ гаргаж авах 10 зөвлөмж
1: RNase-ийн үйл ажиллагаанаас хурдан сэргийлнэ.Дээжийг цуглуулсны дараа хурдан хөлддөг бөгөөд задралын явцад RNase хурдан ажилласнаар идэвхгүй болдог.
2: Рибозимын өндөр агууламжтай эдэд тохирох хандлах аргыг сонгох ба өөхний эдэд фенол агуулсан аргыг хэрэглэх нь хамгийн тохиромжтой.
3: Урьдчилан таамаглах чанар нь Хойд, cDNA номын сангийн барилгад өндөр бүрэн бүтэн байдал, RT-PCR болон RPA (Ribonuclease protect assay) нь өндөр бүрэн бүтэн байдлыг шаарддаггүй.RT-ПГУ нь өндөр цэвэршилт шаарддаг (ферментийн дарангуйлагчийн үлдэгдэл).
4: Нарийвчилсан нэгэн төрлийн болгох нь ургацыг сайжруулах, доройтлыг бууруулах гол түлхүүр юм.
5: РНХ-ийн электрофорез илрүүлэх бүрэн бүтэн байдлыг шалгана уу, 28S: 18S = 2: 1 нь бүрэн шинж тэмдэг, 1: 1 нь ихэнх туршилтуудад зөвшөөрөгддөг.
6: RT-ПГУ-д ДНХ-г зайлуулах, массивын шинжилгээ ДНХ-г арилгахын тулд Dnase I-ийг ашиглах нь хамгийн сайн арга юм.
7: Экзоген ферментийн бохирдлыг багасгах - ферментийг гаднаас импортлох боломжгүй.
8: Бага концентрацитай нуклейн хүчлийг баяжуулахдаа тунадасжуулах урвалжийг нэмнэ.Гэхдээ фермент агуулсан тунадас, ДНХ-ийн бохирдлоос урьдчилан сэргийлэх.
9: РНХ-ийг сайтар уусгаж, шаардлагатай бол 65С-т 5 минут халаана.
тохиромжтой хадгалах арга
-20С-т богино хугацаанд, -80С-т удаан хугацаагаар хадгалах боломжтой.РНХ-ийн гарцыг сайжруулах эхний алхам бол янз бүрийн дээжийн РНХ-ийн агууламж ихээхэн ялгаатай байдгийг ойлгох явдал юм.Элэг, нойр булчирхай, зүрх зэрэг элбэг (2-4уг/мг), тархи, үр хөврөл, бөөр, уушиг, тимус, өндгөвч зэрэг дунд зэргийн элбэг (0.05-2г/мг), давсаг, яс, өөх тос зэрэг бага (<0.05уг/мг) мг).
1: RN-г ялгаруулах эсийг лизаци хийх - хэрвээ РНХ-г гаргахгүй бол гарц буурна.Цахилгаан нэгэн төрлийн болгох нь бусад нэгэн төрлийн болгох аргуудаас илүү сайн ажилладаг ч шингэн азотыг нухах, ферментийн задрал (Лизозим/Литиказа) гэх мэт бусад аргуудтай хослуулах шаардлагатай байж болно.
2: Олборлох аргыг оновчтой болгох.Фенол дээр суурилсан аргуудын хамгийн том асуудал бол бүрэн бус давхаргажилт, РНХ-ийн хэсэгчилсэн алдагдал (хэт шингэнийг бүрэн арилгах боломжгүй) юм.Бүрэн бус давхаргажилт нь нуклейн хүчил, уургийн агууламж өндөртэй холбоотой бөгөөд үүнийг ашигласан лизатын хэмжээг нэмэгдүүлэх эсвэл дээжийн хэмжээг багасгах замаар шийдэж болно.Өөх тосны эдэд хлороформ олборлох үе шатыг нэмсэн.РНХ-ийн алдагдлыг буцааж шахах эсвэл органик давхаргыг арилгах, дараа нь центрифуг хийх замаар бууруулж болно.Баганын төвөөс зугтах аргуудын хамгийн том асуудал бол илүүдэл дээж юм.
Сонгодог олборлох зөвлөмжүүд
1. Фенол цэвэршүүлэх: 1:1 Фенол/Хлороформтой тэнцүү хэмжээгээр нэмээд 1-2 минутын турш хүчтэй холино.2 минутын турш өндөр хурдтайгаар центрифуг хийнэ.Илүүдэл шингэнийг (80-90%) болгоомжтой арилгана.Дунд давхаргад хэзээ ч бүү ор.Фенол/Хлороформд ижил хэмжээний урвалын уусмал нэмж, дээд давхаргыг зайлуулж болно.Ургацыг сайжруулахын тулд хоёр супернатантыг нуклейн хүчлийн тунадасжуулах зорилгоор хольж болно.Холихдоо хэт зөөлөн байж болохгүй, бүх супернатантыг арилгахыг бүү оролд.
2. 70-80%-ийн этанолоор угаах: Угаах явцад давсны үлдэгдэл нь угааж байхын тулд нуклейн хүчлийг түдгэлзүүлсэн байх ёстой.Үүний зэрэгцээ этилийн спиртийг асгасны дараа хэдхэн секундын турш өндөр хурдтайгаар центрифуг хийж, дараа нь этилийн спиртийн үлдэгдлийг пипеткээр зайлуулна.Өрөөний температурт 5-10 минут байлгасны дараа уусгана.
11. Тусгай байгууллагуудын олборлолт
1. Шилэн эд: Зүрх/араг ясны булчин зэрэг фиброз эдээс РНХ гаргаж авах гол зүйл бол эдийг бүрэн тасалдуулах явдал юм.Эдгээр эдүүд нь эсийн нягтрал багатай тул нэгж жинд ногдох РНХ-ийн хэмжээ бага байдаг тул аль болох их хэмжээгээр эхлэх нь зүйтэй.Хөлдөлтийн нөхцөлд эдийг сайтар нунтаглахаа мартуузай.
2. Уураг/өөх тос ихтэй эд: тархи/ургамлын өөхний агууламж өндөр.PCI-ийг гаргасны дараа хэт шингэн нь цагаан флокулуудыг агуулна.Илүүдэл шингэнийг хлороформоор дахин гаргаж авах шаардлагатай.
3. Нуклейн хүчил/рибозимын агууламж өндөртэй эдүүд: дэлүү/тимус нь нуклейн хүчил, рибозимын агууламж өндөртэй байдаг.Хөлдөлтийн нөхцөлд эдийг нунтаглаж, дараа нь хурдан нэгэн төрлийн болгох нь рибозимийг үр дүнтэй идэвхгүй болгодог.Гэсэн хэдий ч, хэрэв лизат нь хэт наалдамхай бол (нуклейн хүчлийн өндөр агууламжаас шалтгаалж) PCI-ийн олборлолт нь үр дүнтэй давхаргажих боломжгүй болно;илүү лизат нэмэх нь энэ асуудлыг шийдэж чадна.Олон тооны PCI олборлолт нь илүү их үлдэгдэл ДНХ-ийг арилгах боломжтой.Хэрэв архи нэмсэн даруйд цагаан тунадас үүсвэл ДНХ-ийн бохирдол байгааг илтгэнэ.Ууссаны дараа хүчиллэг PCI-ээр дахин олборлох нь ДНХ-ийн бохирдлыг арилгах боломжтой.
4. Ургамлын эд: Ургамлын эд нь амьтны эдээс илүү нарийн төвөгтэй байдаг.Ерөнхийдөө ургамал нь шингэн азотын нөхцөлд нунтагладаг тул эндоген ферментийн нөлөөгөөр РНХ задрах нь ховор байдаг.Хэрэв доройтлын асуудал шийдэгдээгүй бол энэ нь дээжинд агуулагдах хольцоос үүдэлтэй байх нь гарцаагүй.Олон ургамалд агуулагдах хольцууд нь үлдэгдэлд хүргэдэг бөгөөд үлдэгдэл үүсэх шалтгаан нь ихэвчлэн эдгээр хольцууд нь РНХ-тэй төстэй байдаг тул та тунадас үүсгэдэг, би тунадас үүсгэдэг, та шингэж, би шингэдэг.Эдгээр шинж чанарууд нь маш хүчтэй фермент дарангуйлагчид гэдгийг тодорхойлдог.
Одоогийн байдлаар арилжааны РНХ олборлох урвалжуудыг жижиг тохируулгатайгаар бараг бүх амьтны эд эсэд тохируулах боломжтой боловч ихэнх ургамлын эдэд тохирох арилжааны РНХ олборлох урвалжууд цөөн байдаг.Аз болоход Foregene онцгой үйлчилгээ үзүүлж чаднаургамлын РНХ олборлох иж бүрдэл, бидэнд байгааУргамлын нийт РНХ тусгаарлах иж бүрдэл, Ургамлын нийт РНХ тусгаарлах иж бүрдэл Plus.Сүүлийнх нь полисахарид ба полифенолын агууламж өндөртэй ургамалд тусгайлан зориулагдсан.РНХ олборлохын тулд лабораторийн хэрэглэгчдийн санал хүсэлт ялангуяа сайн байдаг.
12. Дээжийг хөлдөөх, гэсгээх нөлөө Хөлдөөсөн дээж нь илүү том хэмжээтэй байж болох тул РНХ задлахад ашиглахаас өмнө зүсэх шаардлагатай.Зүсэх явцад дээж хайлах хандлагатай байдаг (магадгүй хэсэгчлэн).Хөлдөөсөн дээжийг РНХ олборлохын өмнө жинлэх шаардлагатай бөгөөд энэ процессын явцад гэсгээх нь гарцаагүй.Заримдаа дээжийг гэсгээх нь шингэн азотын тээрэмдэх явцад тохиолддог;эсвэл хөлдөөсөн дээжийг шингэн азотыг тээрэмдэхгүйгээр лизат руу шууд нэмдэг бөгөөд бүрэн нэгэн төрлийн болгохын өмнө гэсгээх нь гарцаагүй.Туршилтаар хөлдөөсөн эд нь шинэ эдээс илүү гэсэлтийн үед РНХ-ийн задралд өртөмтгий байдгийг харуулсан.Боломжит шалтгаан: Хөлдөөх гэсэлтийн процесс нь эсийн доторх бүтцийг эвдэж, эндоген ферментүүд РНХ-тэй шууд харьцахад хялбар болгодог.
13. РНХ-ийн чанарын дүгнэлт Ихэвчлэн электрофорез нь РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг, A260/A280 нь РНХ-ийн цэвэр байдлыг үнэлэхэд ашиглагддаг.Онолын хувьд бүрэн бүтэн РНХ нь 28S:18S = 2.7:1 харьцаатай байдаг ба ихэнх өгөгдөл нь 28S:18S = 2:1 харьцааг онцолдог.Баримт нь эсээс бусад дээжээс гаргаж авсан РНХ-ийн аль нь ч 2:1 харьцаатай байдаггүй (үүнийг Agilent Bioanalyzer ашиглан олж авсан).
РНХ-ийн электрофорезын үр дүнд хоёрдогч бүтэц, электрофорезын нөхцөл, дээжийн ачаалал, ГЗ-ийн ханалтын зэрэг гэх мэт олон хүчин зүйл нөлөөлдөг. РНХ-г илрүүлэхийн тулд төрөлхийн электрофорез ашиглан ДНХ маркерыг хяналт болгон ашиглана.Хэрэв 28S 2kb ба 18S 0.9kb нь тодорхой, 28S: 18S > 1 бол бүрэн бүтэн байдал нь ихэнх дараагийн туршилтуудын шаардлагыг хангаж чадна.
A260/A280 бол маш их төөрөгдөл үүсгэсэн үзүүлэлт юм.Юуны өмнө нуклейн хүчлийн хувьд энэ үзүүлэлтийн анхны утгыг тодруулах шаардлагатай: цэвэр РНХ, түүний A260/280 = 2.0 орчим.Цэвэр РНХ нь "шалтгаан" бөгөөд A260/A280 = 2 нь "үр нөлөө" юм.Одоо хүн бүр A260/A280-ийг “шалтгаан” болгон ашиглаж, “Хэрэв A260/A280 = 2 бол РНХ цэвэр байна” гэж бодож байгаа нь аяндаа төөрөгдөл үүсгэдэг.
Хэрэв та сонирхож байгаа бол РНХ-ийн дээжинд фенол, гуанидин изотиоцианат, PEG гэх мэт олборлолтод ихэвчлэн хэрэглэгддэг бага зэрэг урвалж нэмж, дараа нь A260/A280 харьцааг хэмжиж болно.Бодит байдал нь РНХ задлахад ашигладаг олон урвалжууд болон дээжинд агуулагдах олон хольцууд нь A260 болон A280-ийг шингээж, A260/A280-д нөлөөлдөг.
Одоогийн байдлаар хамгийн сургамжтай арга бол РНХ-ийн дээжийг 200-300 нм зайд сканнердах явдал юм.Цэвэр РНХ-ийн муруй нь дараах шинж чанартай: муруй нь гөлгөр, A230 ба A260 нь хоёр гулзайлтын цэг, A300 нь 0-д ойрхон, A260/A280 = 2.0 орчим, A260/A230 = 2.0 орчим байна.Хэрэв сканнердсан өгөгдөл байхгүй бол A260/A230 харьцааг мөн тодорхойлох шаардлагатай, учир нь энэ харьцаа нь ферментийн урвалд нөлөөлдөг бүх хольцыг шилжүүлэхэд илүү мэдрэмтгий байдаг.Төхөөрөмжийн шугаман хүрээг анхаарч үзээрэй (A260-ийн хувьд 0.1-0.5).
Өөр хоёр ашигтай үзэгдэл байдаг: A260/A280-ийг усанд хэмжихэд харьцаа 0.3 орчим бага байх болно;харин 10 мМ EDTA-д хэмжсэн харьцаа нь 1 мМ EDTA-д хэмжсэнээс 0.2 орчим өндөр байна.
Холбоотой бүтээгдэхүүн:
Хятадын Ургамлын нийт РНХ тусгаарлах иж бүрдэл үйлдвэрлэгч ба нийлүүлэгч |Foregene (foreivd.com)
РНХ тусгаарлах цуврал – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Шуудангийн цаг: 2022 оны 7-р сарын 15
