Төвийн домогт РНХ нь ДНХ ба уургийн илэрхийлэл хоорондын транскрипцийн зуучлагч гэдгийг сайн мэддэг.ДНХ илрүүлэхтэй харьцуулахад РНХ илрүүлэх нь организм дахь генийн илэрхийлэлийг илүү бодитойгоор тусгаж чаддаг.РНХ-тэй холбоотой туршилтуудад: qRT-PCR, RNA-Seq, хайлуулах ген илрүүлэх гэх мэт орно. РНХ-ийн шинж чанарт үндэслэн (РНХ-ийн сахарын цагираг нь ДНХ-ийн сахарын цагирагаас нэгээр илүү чөлөөт гидроксил бүлэгтэй байдаг) РНХ нь хүрээлэн буй орчинд олон тооны РНазуудтай нийлснээр ДНХ-ээс илүү тогтворгүй бөгөөд задрахад хялбар байдаг.Хог хаягдал, хог хаягдал, хэрэв РНХ-ийн чанар сайн биш бол туршилтын үр дүн хангалтгүй, ялангуяа алдаатай өгөгдөл эсвэл давтагдах чадвар муутай байх ёстой.Тиймээс РНХ-ийн боловсруулалтад илүү анхаарал хандуулах хэрэгтэй бөгөөд дараагийн туршилтын өгөгдлийн нарийвчлал, үнэн зөв байдлыг хангахын тулд чанарын хяналтын холбоос нь илүү чухал юм.

РНХ-ийн чанарыг хянахын тулд ихэвчлэн дараах аргуудыг ашигладаг.

• Спектрофотометр
• агароз гель электрофорез
• Agilent Bioanalyzer
• бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ
• Кубит флюресцент будах арга

01 Спектрофотометр

РНХ нь хосолсон давхар холбоо бөгөөд 260 нм долгионы уртад шингээлтийн дээд цэгтэй.Ламберт-Беэрийн хуулийн дагуу бид РНХ-ийн концентрацийг 260 нм-ийн шингээлтийн оргилоос тооцоолж болно.Үүнээс гадна бид РНХ-ийн цэвэршилтийг 260нм, 280нм, 230нм шингээлтийн оргилуудын харьцаагаар тооцож болно.280нм ба 230нм нь уураг болон жижиг молекулуудын шингээлтийн оргил үе юм.Мэргэшсэн РНХ-ийн цэвэршилтийн A260/A280 ба A260/A230 харьцаа нь 2-оос их байх ёстой. Хэрэв 2-оос бага бол РНХ-ийн дээжинд уураг эсвэл жижиг молекулын бохирдол байгаа бөгөөд дахин цэвэршүүлэх шаардлагатай гэсэн үг юм.Бохирдлын эх үүсвэрүүд нь ПГУ-ын урвалын олшруулалтын үр ашгийг дарангуйлах гэх мэт доод туршилтуудад нөлөөлж, тоон үр дүн нь буруу болно.РНХ-ийн цэвэр байдал нь дараагийн үр дүнд ихээхэн нөлөөлдөг тул спектрофотометр нь нуклейн хүчлийн туршилтын эхний шатанд чанарын хяналтын зайлшгүй холбоос юм.

Зураг 1. Ердийн РНХ/ДНХ шингээлтийн спектр

02 Агароз гель электрофорез

Цэвэршилтээс гадна РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал нь РНХ-ийн чанарыг үнэлэх чухал үзүүлэлтүүдийн нэг юм.РНХ-ийн задрал нь дээжинд олон тооны богино фрагмент үүсэхэд хүргэдэг тул үр дүнтэй илрүүлж, лавлагаа дараалалд хамрагдах РНХ-ийн хэсгүүдийн тоо багасна.РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг 1% агароз гель дээр нийт РНХ-ийн электрофорезоор шалгаж болно.Энэ арга нь гелийг өөрөө тохируулах эсвэл бүрэн бүтэн байдлыг шалгахын тулд угсармал E-Gel™ системийг ашиглаж болно.Нийт РНХ-ийн 80 гаруй хувь нь рибосомын РНХ бөгөөд ихэнх нь 28S ба 18S рРНХ (хөхтөн амьтдын системд) -ээс бүрддэг.Сайн чанарын РНХ нь 5 Kb ба 2 Kb хэмжээтэй 28S ба 18S тод баар болох хоёр тод зураасыг харуулах ба харьцаа нь 2:1-тэй ойролцоо байх хандлагатай байна.Хэрэв энэ нь сарнисан төлөвт байгаа бол энэ нь РНХ-ийн дээжийг задалсан байж болзошгүй гэсэн үг бөгөөд РНХ-ийн чанарыг цаашид шалгахын тулд дараа тайлбарласан аргыг ашиглахыг зөвлөж байна.

Зураг 2. Агароз гель электрофорез дээр доройтсон (2-р эгнээ) болон бүрэн бүтэн РНХ-ийн (3-р эгнээ) харьцуулалт

03 Agilent Bioanalyzer

РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг энгийн бөгөөд хурдан тодорхойлоход туслах агароз гель электрофорезийн аргаас гадна бид РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг тодорхойлохын тулд Agilent биоанализерыг ашиглаж болно.Энэ нь РНХ-ийн концентраци, бүрэн бүтэн байдлыг үнэлэхийн тулд микрофлюидик, капилляр электрофорез, флюресценцийн хослолыг ашигладаг.РНХ-ийн дээжийн профайлд шинжилгээ хийхдээ суурилагдсан алгоритмыг ашигласнаар Agilent биоанализер нь РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлын утгыг (цаашид RIN гэх) [1] тооцоолж чадна.RIN-ийн утга их байх тусам РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал өндөр болно (1 нь маш их доройтсон, 10 нь хамгийн бүрэн гүйцэд).РНХ-тэй холбоотой зарим туршилтууд нь RIN-ийг чанарын үнэлгээний параметр болгон ашиглахыг санал болгож байна.Өндөр хүчин чадалтай дарааллын туршилтуудыг (цаашид NGS гэх) жишээ болгон авч үзвэл, Thermo Fisher-ийн Oncomine самбар дээрх В эс болон Т эсийн эсрэгтөрөгчийн рецепторыг илрүүлэхэд ашигладаг Oncomine™ Хүний дархлааны репертуарын удирдамж нь RIN-ийн утга 4-өөс дээш, илүү үр дүнтэй хэмжигдэхүүнтэй дээжийг унших боломжтойг санал болгож байна.Өөр өөр самбаруудад санал болгож буй өөр өөр мужууд байдаг бөгөөд ихэвчлэн өндөр RIN нь илүү үр дүнтэй өгөгдлийг авчрах боломжтой.

Зураг 3, Oncomine™ Хүний дархлааны репертуарын туршилтанд 4-өөс дээш RIN-тэй дээжүүд илүү үр дүнтэй уншлага болон Т эсийн клоныг илрүүлж чадна.【2】

Гэсэн хэдий ч RIN утга нь зарим хязгаарлалттай байдаг.Хэдийгээр RIN нь NGS туршилтын өгөгдлийн чанарт өндөр хамааралтай боловч FFPE дээжинд тохиромжгүй.FFPE дээжийг удаан хугацааны туршид химийн аргаар боловсруулсан бөгөөд олборлосон РНХ нь ерөнхийдөө харьцангуй бага RIN утгатай байдаг.Гэхдээ энэ нь туршилтын үр дүнтэй өгөгдөл хангалтгүй байх ёстой гэсэн үг биш юм.FFPE дээжийн чанарыг үнэн зөв үнэлэхийн тулд RIN-ээс өөр хэмжилтийг ашиглах шаардлагатай.RIN-ээс гадна Agilent биоанализер нь DV200-ийн утгыг РНХ-ийн чанарын үнэлгээний параметр болгон тооцоолох боломжтой.DV200 нь РНХ дээж дэх 200 bp-ээс их фрагментийн эзлэх хувийг тооцоолох параметр юм.DV200 нь RIN-ээс илүү FFPE дээжийн чанарын үзүүлэлт юм.FFPE-ээр гаргаж авсан РНХ-ийн хувьд үр дүнтэй илрүүлж болох генийн тоо болон генийн олон янз байдалтай маш өндөр хамааралтай байдаг [3].Хэдийгээр DV200 нь FFPE-ийн чанарыг илрүүлэх дутагдлыг нөхөж чаддаг ч Agilent биоанализер нь РНХ-ийн дээжийн чанарын асуудлыг, тэр дундаа дээжинд дарангуйлагч байгаа эсэхийг цогцоор нь шинжилж чадахгүй байна.Дарангуйлагчид өөрсдөө доод туршилтын олшруулалтын үр ашигт нөлөөлж, ашигтай өгөгдлийн хэмжээг бууруулдаг.Дээжинд дарангуйлагч байгаа эсэхийг мэдэхийн тулд бид дараа тайлбарласан бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ-ын аргыг хэрэглэж болно.

04 бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ

Бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ-ын арга нь дээж дэх дарангуйлагчдыг илрүүлэхээс гадна FFPE дээжин дэх РНХ-ийн чанарыг үнэн зөв тусгах боломжтой.Agilent биологийн анализатортой харьцуулахад бодит цагийн флюресценцийн тоон хэмжигдэхүүнүүд өргөн хэрэглээнийхээ ачаар биологийн томоохон лабораториудад илүү түгээмэл байдаг.РНХ-ийн дээжийн чанарыг шалгахын тулд бид зөвхөн GUSB (Cat No. Hs00939627) зэрэг дотоод лавлагааны генийн праймер датчик худалдаж авах эсвэл бэлтгэх хэрэгтэй.Үнэмлэхүй тоон туршилт явуулахын тулд энэхүү праймер, датчик, стандартын багцыг (мэдэгдэж байгаа концентрацийн нийт РНХ) ашигласнаар РНХ-ийн фрагментийн үр дүнтэй концентрацийг РНХ-ийн чанарын үнэлгээний стандарт болгон тооцоолж болно (товчхондоо функциональ РНХ-ийн тоо хэмжээ (FRQ)).NGS туршилтаар бид РНХ дээжийн FRQ нь үр дүнтэй өгөгдлийн эзлэхүүнтэй маш өндөр хамааралтай болохыг олж мэдсэн.0.2ng/uL FRQ-аас их бүх дээжийн хувьд уншилтын дор хаяж 70% нь лавлагааны дарааллыг үр дүнтэй хамарч чадна (Зураг 4).

Зураг 4, флюресценцийн тоон аргаар илрүүлсэн FRQ утга нь NGS туршилтаар олж авсан үр дүнтэй өгөгдөлтэй маш өндөр хамааралтай (R2>0.9) байна.Улаан шугам нь 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) -тай тэнцүү FRQ утга юм.【4】

FFPE дээжинд хэрэглэхээс гадна бодит цагийн тоон ПГУ-ын арга нь дээж дэх дарангуйлагчдыг үр дүнтэй хянах боломжтой.Бид илрүүлэх дээжийг дотоод эерэг хяналт (IPC) болон түүний шинжилгээ бүхий урвалын системд нэмж, дараа нь Ct утгыг авахын тулд флюресценцийн хэмжилт хийж болно.Хэрэв дээжгүй урвалд Ct утга нь Ct-ийн утгаас хоцорч байвал энэ нь дээжинд дарангуйлагч байгааг илтгэж, урвалын олшруулалтын үр ашгийг саатуулдаг.

05 Qubit флюресцент будах арга

Кубит флюрометр нь нуклейн хүчлийн концентраци болон цэвэршилтийг тодорхойлоход хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг жижиг төхөөрөмж бөгөөд ажиллахад хялбар бөгөөд молекул биологийн бараг бүх лабораторид байдаг.Энэ нь нуклейн хүчлийн агууламжийг нуклейн хүчлийг холбогч флюресцент будаг (Qubit илрүүлэх урвалж) илрүүлж нарийн тооцоолдог.Кубит нь өндөр мэдрэмжтэй, өвөрмөц шинж чанартай бөгөөд РНХ-ийг pg/μL концентраци хүртэл нарийвчлалтай тоолж чаддаг.Термо Фишерийн хамгийн сүүлийн үеийн шинэ загвар болох Qubit 4.0 нь нуклейн хүчлийн концентрацийг үнэн зөв тодорхойлох сайн мэддэг чадвараас гадна РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг илрүүлж чаддаг.Qubit 4.0-ийн РНХ илрүүлэх систем (RNA IQ Assay) нь хоёр тусгай флюресцент будагч бодисыг нэгэн зэрэг илрүүлэх замаар РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг илрүүлдэг.Эдгээр хоёр флюресцент будаг нь РНХ-ийн том хэсгүүд болон жижиг хэсгүүдтэй холбогдож чаддаг.Эдгээр хоёр флюресцент будаг нь дээжинд агуулагдах РНХ-ийн том хэсгүүдийн эзлэх хувийг заадаг бөгөөд үүнээс РНХ-ийн чанарыг илэрхийлэх IQ (Бүрэн бүтэн байдал ба Чанар)-ын утгыг тооцоолж болно.IQ утга нь FFPE болон FFPE бус дээжийн аль алинд нь хамаарах бөгөөд дараагийн дарааллын чанарт ихээхэн нөлөөлдөг.NGS туршилтыг жишээ болгон авч үзвэл, Ion torrent™ платформ дээр хийсэн RNA-Seq туршилтын туршилтанд 4-өөс дээш IQ утгатай ихэнх дээжүүд дор хаяж 50%-ийн үр дүнтэй уншилттай байсан (Зураг 5).Дээр дурдсан илрүүлэх аргуудтай харьцуулахад Qubit IQ Assay нь ажиллахад илүү тохиромжтой бөгөөд бага хугацаа шаарддаг (таван минутын дотор) төдийгүй хэмжсэн параметрийн IQ утга болон доод туршилтын өгөгдлийн чанар хоёрын хооронд маш их хамааралтай байдаг.

Зураг 5, Qubit RNA IQ утга болон RNA-Seq-ын зурагласан уншилтуудын хооронд маш их хамаарал байна.【5】

Дээрх танилцуулгаар дамжуулан хүн бүр РНХ-ийн чанарын хяналтын янз бүрийн аргуудын талаар хангалттай ойлголттой байдаг гэдэгт би итгэдэг.Практикт та сонгож болнодээжийн төрөл болон одоо байгаа багаж хэрэгслийн дагуу тохирох арга.Зөвхөн РНХ-ийн чанарыг сайтар хянаж байж бид дээжийн чанар муугаас үүдэлтэй дараагийн туршилтууд бүтэлгүйтэхээс зайлсхийж, үнэт цаг, эрчим хүч, зардлыг хэмнэдэг.

Лавлах бүтээгдэхүүн:

Амьтны нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Эсийн нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

лавлагаа

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: РНХ хэмжилтийн бүрэн бүтэн байдлын утгыг тодорхойлох РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлын дугаар.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine хүний ​​дархлааны репертуарын хэрэглэгчийн гарын авлага (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Леа Си Вехмас, Чарльз Е Вуд, Брайан Н Чорли, Кэрол Л Яук, Гэйл М Нелсон, Сюзан Д Хестер, Архивын формалинаар бэхлэгдсэн парафин шингээсэн эдийн дээжээс авсан РНХ-ийн үнэлгээний сайжруулсан чанарын хэмжигдэхүүн, Хор судлалын шинжлэх ухаан, 17-р сарын 17, 12-р хуудас 7–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/