1. Анхны ойлголт

Энэ үе шатанд бид ахмад настнуудын өмнө алдаа гаргахгүйн тулд зарим ойлголт, нэр томъёог ойлгох хэрэгтэй, тухайлбал:

А: RT-PCR, qPCR, Real-time ПГУ, бодит цагийн RT-PCR хоёрын ялгаа юу вэ?

Хариулт: RT-PCR нь урвуу транскрипцийн ПГУ юм(урвуу транскрипцийн ПГУ, RT-ПГУ) нь полимеразын гинжин урвалын (ПГУ) өргөн хэрэглэгддэг хувилбар юм.RT-ПГУ-д РНХ-ийн хэлхээг урвуу байдлаар нэмэлт ДНХ болгон хувиргаж, дараа нь ПГУ-аар ДНХ-ийг олшруулах загвар болгон ашигладаг.
Бодит цагийн ПГУ ба qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) нь ижил зүйл бөгөөд хоёулаа бодит цагийн тоон ПГУ бөгөөд энэ нь ПГУ-ын мөчлөг бүр бодит цагийн өгөгдлийн бүртгэлтэй байдаг тул эхлэх загваруудын тоог нарийн шинжилгээгээр тохируулах боломжтой гэсэн үг юм.

Хэдийгээр бодит цагийн ПГУ (бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ) болон урвуу транскрипцийн ПГУ (урвуу транскрипцийн ПГУ) нь RT-PCR гэж товчилсон мэт боловч олон улсын конвенцид: RT-PCR нь урвуу транскрипцийг тусгайлан хэлнэ.ПГУ, Бодит цагийн ПГУ-ыг ерөнхийдөө qPCR (тоон бодит цагийн ПГУ) гэж товчилдог..

Мөн бодит цагийн RT-PCR (RT-qPCR), Энэ нь флюресцент тоон технологитой хослуулсан урвуу транскрипцийн ПГУ юм.: эхлээд РНХ-ийн урвуу транскрипцээс cDNA (RT) авч, дараа нь тоон шинжилгээнд (qPCR) Бодит цагийн ПГУ-ыг ашиглана.Ихэнх лабораториуд RT-qPCR, өөрөөр хэлбэл РНХ-ийн илэрхийлэлийг бууруулах зохицуулалтын судалгаа хийдэг тул лабораторид хүн бүрийн ярьдаг qPCR нь үнэндээ RT-qPCR-д хамаарах боловч эмнэлзүйн хэрэглээнд ДНХ-ийн олон сорил байдгийг мартаж болохгүй.Гепатит В вирусын HBV илрүүлэх гэх мэт тоон шинжилгээ.

Асуулт: Олон тооны флюресцент тоон ПГУ-ыг уншсаны дараа яагаад олшруулсан фрагментийг 80-300bp-ийн хүрээнд хянах ёстой вэ?

Хариулт: Генийн дараалал бүрийн урт нь өөр, зарим нь хэд хэдэн кб, зарим нь хэдэн зуун bp байдаг, гэхдээ бид праймерыг зохион бүтээхдээ зөвхөн бүтээгдэхүүний уртыг 80-300bp шаарддаг, хэт богино эсвэл хэт урт нь флюресцент тоон ПГУ-ыг илрүүлэхэд тохиромжгүй.Бүтээгдэхүүний фрагмент нь праймер-димерээс ялгахад хэтэрхий богино байна.Праймер-димерийн урт нь ойролцоогоор 30-40bp бөгөөд 80bp-ээс бага бол праймер-димер эсвэл бүтээгдэхүүн эсэхийг ялгахад хэцүү байдаг.Хэрэв бүтээгдэхүүний хэсэг хэтэрхий урт буюу 300 бит-ээс их байвал олшруулалтын үр ашиг багасч, генийн хэмжээг үр дүнтэй илрүүлэх боломжгүй болно.

Жишээлбэл, нэг ангид хэдэн хүн байгааг тоолохдоо хэдэн амтайг тоолоход л хангалттай.Та генийг илрүүлэхэд мөн адил зүйл тохиолддог, та зөвхөн генийн тодорхой дарааллыг илрүүлэхэд л бүх дараалал хийх болно.Хүнийг тоолъё гэвэл ам хамар, чих, нүдний шил аль алиныг нь тоолох хэрэгтэй, алдаа гаргахад амархан.

Биологийн судалгааг өргөжүүлэхийн тулд аль ч зүйлийн генийн дараалал нь маш урт байдаг тул бүх хэлтэрхийг хэмжих шаардлагагүй, жишээлбэл, нянгийн 16S дараалал, өөрөөр хэлбэл бактерийн консерватив дарааллаар тодорхой тооны нянгийн тоог гаргахын тулд шинжилгээ хийх боломжгүй байдаг.

А: qPCR праймерын дизайны хамгийн оновчтой урт нь юу вэ?

Хариулт: Ерөнхийдөө праймерын урт нь ойролцоогоор 20-24bp бөгөөд энэ нь илүү дээр юм.Мэдээжийн хэрэг, праймерыг төлөвлөхдөө бид праймерын TM утгыг анхаарч үзэх ёстой, учир нь энэ нь хамгийн оновчтой температуртай холбоотой юм.Олон туршилтын үр дүнд 60°C нь илүү сайн TM утга болох нь батлагдсан.Хэрэв зөөлрүүлэх температур хэт бага байвал энэ нь өвөрмөц бус олшруулалтад амархан хүргэдэг.Хэрэв анивчих температур хэт өндөр байвал олшруулалтын үр ашиг харьцангуй бага байх ба олшруулалтын муруйн оргил үе нь хожуу эхэлж, CT утга хойшлогдох болно.

А: Будах арга нь датчикийн аргаас юугаараа ялгаатай вэ?

Хариулт: Будах аргаSYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO гэх мэт зарим флюресцент будагч бодисууд нь өөрөө гэрэл ялгаруулдаггүй, харин хоёр судалтай ДНХ-ийн жижиг ховилтой холбогдсоны дараа флюресцент ялгаруулдаг.Тиймээс ПГУ-ын урвалын эхэн үед машин флюресцент дохиог илрүүлж чадахгүй.Урвал нь анивчих-суналтын үе шатанд хүрэхэд давхар хэлхээ нээгдэж, ДНХ полимеразын нөлөөн дор шинэ хэлхээ нийлэгжиж, флюресцент молекул нь dsDNA-ийн жижиг ховилтой холбогддог.ПГУ-ын мөчлөгийн тоо нэмэгдэхийн хэрээр олон тооны будагч бодисууд давхар судалтай ДНХ-тэй нэгдэж, флюресцент дохио нь мөн тасралтгүй нэмэгддэг.Будах аргыг шинжлэх ухааны судалгаанд голчлон ашигладаг.
Жич: Туршилт хийхдээ болгоомжтой байгаарай, будагч бодис нь хүний ​​ДНХ-тэй нийлсэн байх ёстой, флюресцент хүн болгохоос болгоомжил.

Будах арга (зүүн талд) Сорьцын арга (баруун)
Жич: Туршилт хийхдээ болгоомжтой байгаарай, будагч бодис нь хүний ​​ДНХ-тэй нийлсэн байх ёстой, флюресцент хүн болгохоос болгоомжил.

SYBR Green Ⅰ нь ДНХ-ийн жижиг ховилтой холбогддог

Шинжилгээний аргаТакман датчик нь хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг гидролизийн датчик юм.Сорьцын 5′ төгсгөлд флюресцент бүлэг байдаг бөгөөд ихэвчлэн FAM байдаг бөгөөд уг датчик нь зорилтот генийн нэмэлт дараалал юм.3′ төгсгөлд флюресцент унтраах бүлэг байдаг.Флюресценцийн резонансын энерги дамжуулах зарчмын дагуу (Förster resonance energy transfer, FRET) сурвалжлагч флюресцент бүлэг (донор флюресцент молекул) ба унтраах флюресцент бүлэг (хүлээн авагч флюресцент молекул) өдөөгдөж байх үед Спектрүүд давхцаж, зай нь маш ойрхон (7-10 нм флюресцент молекул) өдөөх үед), хүлээн авагч молекул, харин автофлуоресценц сулардаг.Тиймээс ПГУ-ын урвалын эхэн үед датчик нь системд чөлөөтэй, бүрэн бүтэн байх үед сурвалжлагч флюресцент бүлэг нь флюресцент ялгаруулдаггүй.Загварлах үед праймер болон датчик нь загварт холбогддог.Сунгах үе шатанд полимераз нь шинэ гинжийг тасралтгүй нэгтгэдэг.ДНХ полимераз нь 5′-3′ экзонуклеазын идэвхжилтэй.Зонд хүрэх үед ДНХ полимераз нь загвараас мэдрэгчийг гидролиз болгож, сурвалжлагч флюресцент бүлгийг унтраагч флюресцент бүлгээс салгаж, флюресцент дохиог гаргана.Сорьц болон загвар хоёрын хооронд ганцаарчилсан хамаарал байдаг тул датчикийн арга нь туршилтын нарийвчлал, мэдрэмжийн хувьд будах аргаас давуу юм.Оношлогооны аргыг голчлон ашигладаг.

А: Үнэмлэхүй хэмжигдэхүүн гэж юу вэ?Харьцангуй тоон үзүүлэлт гэж юу вэ?

Хариулт: Үнэмлэхүй хэмжигдэхүүн гэдэг нь 1мл цусанд хэдэн HBV вирус байгаа гэх мэт qPCR шинжилгээнд хамрагдах дээжийн анхны хуулбарын тоог тооцоолохыг хэлнэ.Харьцангуй тоон үзүүлэлтээр олж авсан үр дүн нь тодорхой дээжинд байгаа зорилтот генийн хэмжээг өөр лавлагаатай харьцуулсан өөрчлөлт бөгөөд генийн илэрхийлэл нь дээш буюу доош зохицуулалттай байдаг.

А: РНХ-ийн олборлолтын хэмжээ, урвуу транскрипцийн үр ашиг, олшруулалтын үр ашиг туршилтын үр дүнд нөлөөлөх үү?
Асуулт: Дээж хадгалах, хандлах урвалж, урвуу транскрипцийн урвалж, гэрэл дамжуулагч бодисууд туршилтын үр дүнд нөлөөлөх үү?
Асуулт: Туршилтын өгөгдлийг ямар аргаар засах вэ?

Эдгээр асуудлуудын талаар бид доорх дэвшилтэт болон дэвшилтэт хэсгүүдэд дэлгэрэнгүй тайлбарлах болно.
2. Ахисан түвшний мэдлэг

Бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ-ын тухайд бид жил бүр олон мянган эрдэм шинжилгээний өгүүлэл хэвлэгддэг бөгөөд тэдгээрийн дотор флюресцент тоон ПГУ-ын технологи нь бага тоо биш гэдгийг бид хүлээн зөвшөөрөх ёстой.

Хэрэв флюресцент тоон ПГУ-ын туршилтыг хэмжих нийтлэг стандарт байхгүй бол үр дүн нь ихээхэн ялгаатай байж болно.Нэг төрлийн ижил төрлийн генийн хувьд, ижил боловсруулалтын аргаар илрүүлсэн үр дүн нь маш их ялгаатай байх ба хожимдсон хүмүүст ижил үр дүнг давтахад хэцүү байх болно.Та аль нь зөв, аль нь буруу болохыг хэн ч мэдэхгүй.

Энэ нь флюресцент тоон ПГУ нь хууран мэхлэх технологи эсвэл найдваргүй технологи гэсэн үг үү?Үгүй ээ, учир нь флюресцент тоон ПГУ нь илүү мэдрэмтгий, илүү нарийвчлалтай байдаг бөгөөд бага зэрэг буруу үйлдэл нь огт эсрэг үр дүнд хүргэдэг.Жижиг алдагдал нь мянган милийн зайд байдаг.Нийтлэлийн зохиогчийг тоймчид удаа дараа эрүүдэн шүүж болно.Үүний зэрэгцээ сэтгүүлийн тоймчид өөр өөр туршилтын үр дүнгээс сонгоход хэцүү байдаг.

Энэ бүхэн нь бодит цагийн ПГУ-ын туршилтуудад зөвшилцөлд хүрэхгүй байгааг харуулж байна.Үүний тулд салбарын ахмад эрдэмтэд стандартыг боловсруулж эхэлсэн.Эдгээр стандартыг хангахын тулд нийтлэлд шаардлагатай туршилтын болон өгөгдөл боловсруулах зарим дэлгэрэнгүй мэдээллийг (шаардлагатай өгөгдлийг оруулаад) оруулахыг оролцогчдоос шаардах.

Шүүгчид эдгээр дэлгэрэнгүй мэдээллийг уншсанаар туршилтын чанарыг дүгнэж болно;Ирээдүйн уншигчид үүнийг туршилтыг давтах эсвэл туршилтыг сайжруулахад ашиглаж болно.Тэгвэл ийм аргаар олж авсан туршилтын үр дүн нь мэдээллээр дүүрэн, чанартай, хэрэглэхэд тохиромжтой.

MIBBI (Биологийн болон биоанагаахын судалгаанд зориулсан хамгийн бага мэдээлэл -http://www.mibbi.org) бий болсон.MIBBI бол туршилтын стандартыг хангадаг төсөл юм.Энэ нь байгальд хэвлэгдсэн байдаг.Энэхүү төсөл нь эсийн биологи, Microarray, qPCR гэх мэт төрөл бүрийн биологийн туршилтуудад чиглэгдсэн бөгөөд гар бичмэлийг илгээхдээ туршилтын төрөл бүрийг тусгасан болно.Ийм мэдээллийг байнга өгөх ёстой.

MIBBI төсөлд флюресцент тоон ПГУ-тай холбоотой хоёр нийтлэл байдаг.:
·RDML (Бодит цагийн ПГУ-ын өгөгдлийн тэмдэглэгээний хэл) – бодит цагийн тоон ПГУ-ын өгөгдөлд зориулсан бүтэцлэгдсэн хэл, тайлагнах гарын авлага;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – бодит цагийн тоон ПГУ-ын туршилтуудын тухай нийтлэл нийтлэх хамгийн бага мэдээлэл.
Эхлээд нэр томъёоны тодорхойлолт болох RDML-ийн талаар ярилцъя.

Хэрэв бүх зүйлд стандарт тодорхойлолт байхгүй бол хэлэлцүүлгийг үргэлжлүүлэх боломжгүй тул шалгалтанд нэр томъёоны тайлбар маш чухал байдаг.
Флюресцент тоон ПГУ-ын туршилтанд ашигласан нэр томъёо нь дараах агуулгыг агуулна.QIAGEN бидэнд хамгийн сайн дүгнэлтийг хийсэн.Дараахь зүйлс бүгд хуурай байнабараа .

Олшруулах муруй
Олшруулалтын муруй нь ПГУ-ын процессын явцад хийгдсэн муруйг хэлдэг бөгөөд мөчлөгийн дугаарыг абсцисса, урвалын үеийн бодит цагийн флюресценцийн эрчмийг ординат гэж нэрлэдэг.

Маш сайн олшруулалтын муруй нь дараах шинж чанартай байх ёстой: суурь нь хавтгай эсвэл бага зэрэг буурсан, өсөх хандлага илт байхгүй;муруйн гулзайлтын цэг тодорхой, экспоненциал фазын налуу нь олшруулалтын үр ашигтай пропорциональ байна.Налуу нь их байх тусам олшруулалтын үр ашиг өндөр байх болно;олшруулалтын нийт муруй Зэрэгцээ байдал сайн байгаа нь хоолой бүрийн олшруулалтын үр ашиг ойролцоо байгааг харуулж байна;бага концентрацитай дээжийн олшруулах муруйн экспоненциал үе шат нь тодорхой байна.

Суурь (суурь)
Суурь нь эхний мөчлөгийн дуу чимээний түвшин юм, ихэвчлэн 3-аас 15-р мөчлөгийн хооронд хэмжигддэг, учир нь олшруулах бүтээгдэхүүнээс үүссэн флюресценцийн утгыг энэ хугацаанд илрүүлэх боломжгүй.Суурь үзүүлэлтийг тооцоолоход ашигладаг мөчлөгийн тоо янз бүр байж болох бөгөөд хэрэв загвар их хэмжээгээр хэрэглэж байгаа эсвэл зорилтот генийн илэрхийллийн түвшин өндөр байвал багасгах шаардлагатай байж болно.

Суурь шугамыг тогтоохын тулд шугаман олшруулалтын муруйгаас флюресценцийн өгөгдлийг харах шаардлагатай.Суурь шугамыг олшруулалтын муруйн өсөлт нь үндсэн мөчлөгийн дээд тооноос их мөчлөгийн тоогоор эхлэхээр тохируулсан.Суурь үзүүлэлтүүдийг зорилтот дараалал тус бүрээр тус тусад нь тогтоох шаардлагатай.Эрт мөчлөгт илэрсэн флюресценцийн дундаж утгыг олшруулсан бүтээгдэхүүнээс олж авсан флюресценцийн утгуудаас хасах шаардлагатай.Төрөл бүрийн бодит цагийн ПГУ-ын хамгийн сүүлийн үеийн хувилбарууд нь дээжийн үндсэн тохиргоог автоматаар оновчтой болгох боломжийг олгодог.

ПГУ-ын олшруулах урвалын эхний хэдэн мөчлөгийн үед флюресценцийн дохио тийм ч их өөрчлөгддөггүй.Шулуун шугам руу ойртохыг суурь шугам гэж нэрлэдэг боловч эхний хэдэн мөчлөгийг сайтар ажиглавал доорх зурган дээрх үндсэн шугамд юу болж байгааг харж болно.

Background Background-д хамаарна
урвал дахь өвөрмөц бус флюресценцийн утга.Жишээ нь: үр ашиггүй флюресценцийг унтраах;эсвэл SYBR Green-ийн хэрэглээтэй холбоотой олон тооны давхар хэлхээтэй ДНХ-ийн загварууд.Бодит цагийн ПГУ-ын программ хангамжийн алгоритмаар дохионы суурь бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг математик аргаар арилгадаг.

Сурвалжлагчийн дохио
Сурвалжлагч дохио нь бодит цагийн ПГУ-ын үед SYBR Green эсвэл флюресцентээр хаяглагдсан дарааллын тусгай датчикаар үүсгэсэн флюресцент дохиог хэлнэ.

Хэвийн сурвалжлагч дохио (RN)
RN нь сурвалжлагч будгийн флюресценцийн эрчмийг цикл бүрт хэмжсэн идэвхгүй лавлагааны будгийн флюресценцийн эрчимд хуваасаныг хэлнэ.

Идэвхгүй лавлагаа будаг
Зарим бодит цагийн ПГУ-д,ROX флюресцент будаг нь флюресцент дохиог хэвийн болгохын тулд дотоод лавлагаа болгон ашигладаг.Энэ нь буруу соруулж, худгийн байрлал, флюресценцийн хэлбэлзлээс шалтгаалсан өөрчлөлтийг худаг тус бүрээр засдаг.

Флюресценцийн босго (босго)
дэвсгэр утгаас дээш, олшруулалтын муруйн тэгш өндөрлөгийн утгаас нэлээд доогуур тохируулсан.Энэ нь ПГУ-ын илрүүлэлтийн лог-шугаман хүрээг илэрхийлэх олшруулалтын муруйн шугаман мужид байх ёстой.ПГУ-ын лог-шугаман үе шатыг хялбархан тодорхойлохын тулд лог-олшруулах муруйн харагдац дээр босго оноог тогтоох ёстой.Бодит цагийн ПГУ-д олон зорилтот ген байгаа бол зорилт тус бүрт босго тогтоох шаардлагатай.Ерөнхийдөө ПГУ-ын урвалын эхний 15 мөчлөгийн флюресценцийн дохиог флюресценцийн арын дохио болгон ашигладаг бөгөөд флюресценцийн босго нь ПГУ-ын эхний 3-15 циклийн флюресценцийн дохионы стандарт хазайлтаас 10 дахин их байдаг ба флюресценцийн босгыг ПГУ-ын амплонжуулалтын үе шатанд тогтоодог.Ерөнхийдөө багаж бүрийг хэрэглэхийн өмнө флюресценцийн босго тогтоосон байдаг.

Циклийн босго (CT) эсвэл огтлолцох цэг (CP)
Олшруулалтын муруй босгыг давах мөчлөг (өөрөөр хэлбэл флюресценцийн илрүүлэлт мэдэгдэхүйц нэмэгдэх цэг).CT нь бутархай байж болох ба эхлэх загварын хэмжээг тооцоолж болно.CT-ийн утга нь ПГУ-ын урвалын хоолой бүр дэх флюресцент дохио тогтоосон босго хэмжээнд хүрэх үед тохиолдсон мөчлөгийн тоог илэрхийлнэ.Загвар бүрийн CT утга ба загварын анхны хуулбарын дугаарын логарифмын хооронд шугаман хамаарал байдаг.Эхний хуулбарын тоо өндөр байх тусам CT утга бага байх ба эсрэгээр.Анхны хуулбарын дугаар нь мэдэгдэж байгаа стандартыг ашиглан стандарт муруйг хийж болох бөгөөд абсцисса нь CT утгыг, ордны тэмдэг нь анхны хуулбарын дугаарын логарифмыг илэрхийлнэ.Тиймээс үл мэдэгдэх дээжийн CT утгыг олж авсан л бол дээжийн анхны хуулбарын дугаарыг стандарт муруйгаар тооцоолж болно.

ΔCT утга
ΔCT утгыг тайлбарланазорилтот ген ба харгалзах эндоген лавлагаа генийн CT утгын хоорондох ялгаа, тухайлбал гэрийн үйлчлэгч ген ба ашигласан загварын хэмжээг хэвийн болгоход ашигладаг:
⇒ΔCT = CT (зорилтот ген) – CT (эндоген лавлагаа ген)

ΔΔCT утга
ΔΔCT утга нь сонирхсон түүврийн дундаж ΔΔCT утга (жишээ нь, өдөөгдсөн эсүүд) болон жишиг дээжийн дундаж ΔΔCT утга (жишээ нь, өдөөгдөөгүй эсүүд) хоорондын зөрүүг тодорхойлдог.Лавлагаа дээжийг мөн шалгалт тохируулгын дээж гэж нэрлэдэг бөгөөд бусад бүх дээжийг харьцангуй хэмжигдэхүүнээр нормчилдог.
⇒ΔΔCT = дундаж ΔCT (сонирхлын түүвэр) – дундаж ΔCT (лавлагаа түүвэр)

Эндоген лавлагаа генүүд (эндоген лавлагаа генүүд)
Гэр ахуйн ген (гэр ахуйн ген) зэрэг эндоген лавлагаа генүүдийн илэрхийллийн түвшин нь дээжийн хооронд ялгаатай байдаггүй.Лавлах генийн CT утгыг зорилтот гентэй харьцуулах нь зорилтот генийн илэрхийллийн түвшинг оролтын РНХ эсвэл cDNA-ийн хэмжээгээр хэвийн болгох боломжийг олгодог (дээрх ΔCT утгын хэсгийг үзнэ үү).

Дотоод лавлагаа ген нь зөвболзошгүй РНХ задрал эсвэл РНХ-ийн дээжинд ферментийн дарангуйлагч байгаа эсэх, түүнчлэн РНХ-ийн агууламжийн өөрчлөлт, урвуу транскрипцийн үр ашиг, нуклейн хүчлийг сэргээх, дээжтэй ажиллах зэрэг.Оновчтой лавлагаа ген(үүд)-ийг сонгохын тулд бид алгоритмыг өөрчилсөн бөгөөд туршилтын тохиргооноос хамааран оновчтой лавлагааг сонгох боломжийг олгосон.

Дотоод хяналт
Зорилтот дараалалтай ижил урвалаар олшруулж, өөр датчикаар шалгадаг хяналтын дараалал (өөрөөр хэлбэл, хоёр талт ПГУ хийх).Зорилтот дараалал илрээгүй гэх мэт амжилтгүй өсгөлтийг үгүйсгэхийн тулд дотоод хяналтыг ихэвчлэн ашигладаг.
Шалгалт тохируулгын дээж
Генийн харьцангуй илэрхийллийн түвшинг тодорхойлохын тулд бусад бүх дээжийг харьцуулахын тулд харьцангуй тоон үзүүлэлтэд ашигласан лавлагаа дээж (жишээлбэл, эсийн шугам эсвэл эдээс цэвэршүүлсэн РНХ).Шалгалт тохируулгын дээж нь ямар ч дээж байж болох боловч ихэвчлэн хяналт (жишээлбэл, боловсруулаагүй дээж эсвэл туршилтын тэг цагийн дээж) байдаг.

Эерэг хяналт
хяналтын урвалыг ашигланмэдэгдэж байгаа хэмжээний загвар.Праймер багц эсвэл праймер-датчикийн багц зөв ажиллаж, урвал зөв тохируулагдсан эсэхийг шалгахын тулд эерэг хяналтыг ихэвчлэн ашигладаг.

Загварын хяналт байхгүй (NTC)
Ихэвчлэн усаар солигддог загвараас бусад олшруулах урвалын бүх шаардлагатай бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг агуулсан хяналтын урвал.NTC-ийг ашигласнаар урвалжийн бохирдол эсвэл гадны ДНХ-ээс үүссэн бохирдлыг илрүүлэх боломжтой бөгөөд ингэснээр илрүүлэлтийн мэдээллийн үнэн зөв, найдвартай байдлыг хангана.ГССҮТ-ийн хяналтыг олшруулах нь бохирдсоныг илтгэнэ.

RT хяналт байхгүй (NRT)
РНХ олборлох үйл явц нь геномын үлдэгдэл ДНХ-г агуулж болох бөгөөд энэ нь маш их хор хөнөөлтэй бөгөөд өгөгдлийн чанарт нөлөөлдөг буруутан бөгөөд qPCR-ийн байгалийн дайсан тул туршилтыг зохион бүтээхдээ зөвхөн РНХ илрүүлэлтийг нэмэгдүүлэх зорилготой байх ёстой.Хоёр арга бий, нэг нь интроноор дамждаг праймеруудыг зохион бүтээх, нөгөө нь ДНХ-ийг бүрмөсөн устгах, аль нь илүү дээр вэ гэдгийг дараа хэлэлцэх болно.NTR удирдлага нь ДНХ-ийн бохирдлыг илрүүлэх шидэт толь юм.Хэрэв олшруулалт байгаа бол бохирдол байна гэсэн үг.

Стандартууд
Стандартууд нь стандарт муруйг бүтээхэд ашигладаг концентраци эсвэл хуулбарын дугаартай дээж юм.Стандартын тогтвортой байдлыг хангахын тулд генийн фрагментийг ихэвчлэн плазмид болгон хувилж стандарт болгон ашигладаг.

Стандарт муруй
ихэвчлэн хоёр дахин нэмэгдүүлэх харьцааны дагуу стандарт бүтээгдэхүүнтэй дор хаяж 5 концентрацийн градиент болгон шингэлж, CT-ийн утга ба хуулбарын дугаарын координатад 5 цэгийг зурж, цэгүүдийг холбож, стандарт муруй үүсгэдэг.Стандарт муруй бүрийн хувьд түүний хүчинтэй эсэхийг шалгах шаардлагатай.Налуугийн утга нь –3.3-аас –3.8 хооронд байх ба концентрац бүрийг гурав дахин хийнэ.Бусад цэгүүдээс эрс ялгаатай цэгүүдийг хаях хэрэгтэй.Шинжилгээнд хамрагдах дээжийн CT-ийн утгыг стандарт муруйд оруулж, сорилтод хамрагдах дээжийн илэрхийллийн түвшинг тооцоолж болно.

Шинжилгээнд хамрагдах дээжийн CT-ийн утгыг стандарт муруйд оруулж, туршилтын дээжийн анхны хуулбарын дугаарыг тооцоолж болно.

Үр ашиг ба налуу
Стандарт муруйны налуу нь бодит цагийн ПГУ-ын үр ашгийг илэрхийлдэг.
·-3.322 налуу нь ПГУ-ын олшруулалтын үр ашиг 1 буюу 100% үр ашигтай, ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээ мөчлөг бүрт хоёр дахин нэмэгддэг болохыг харуулж байна.
· –3.322 (жишээ нь, –3.8)-аас бага налуу нь ПГУ-ын үр ашгийг илтгэнэ
· –3.322 (жишээ нь, –3.0)-аас их налуу нь ПГУ-ын үр ашиг 100% -иас их байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь сонин байна. ПГУ-ын нэг мөчлөг нь олшруулсан бүтээгдэхүүнээс хоёр дахин ихийг хэрхэн үүсгэх вэ?Энэ нөхцөл байдал нь ПГУ-ын урвалын шугаман бус үе шатанд тохиолддог, өөрөөр хэлбэл их хэмжээний өвөрмөц бус олшруулалт байдаг.

хайлах муруй
qPCR олшруулалт дууссаны дараа ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг халаана.Температур өсөхийн хэрээр хоёр судалтай олшруулах бүтээгдэхүүн аажмаар хайлж, флюресценцийн эрчмийг бууруулдаг.Тодорхой температурт (Tm) хүрэхэд олон тооны бүтээгдэхүүн хайлах болно.Флюресценц огцом буурдаг.Төрөл бүрийн ПГУ-ын бүтээгдэхүүнүүд нь өөр өөр Tm-ийн утга, өөр өөр хайлах температуртай байдаг тул ПГУ-ын өвөрмөц байдлыг тодорхойлох боломжтой.

Хайлах муруй (үүсмэл муруй)
Хайлах муруй нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний фрагментуудын нөхцөл байдлыг илүү ойлгомжтойгоор харуулах оргил газрын зургийг үүсгэхийн тулд үүссэн.Хайлах температур нь ДНХ-ийн фрагментийн Tm утга учир фрагментийн хэмжээ, GC-ийн агууламж гэх мэт ДНХ-ийн фрагментийн Tm утгад нөлөөлөх зарим параметрүүдийг шүүж болно. Ерөнхийдөө манай праймер дизайны зарчмуудын дагуу,олшруулсан бүтээгдэхүүний урт нь 80-300bp хооронд хэлбэлздэг тул хайлах температур нь 80 ° C-аас 90 ° C хооронд байх ёстой.

Хайлах муруйны тайлбар: Хэрэв цорын ганц гол оргил нь 80 ° C-90 ° C-ийн хооронд гарч ирвэл энэ нь флюресцент тоон ПГУ төгс гэсэн үг юм;Хэрэв гол оргил нь 80 ° C-90 ° C-ийн хооронд, 80 ° C-аас доош температурт янз бүрийн оргилууд гарч байвал праймер димерийг үндсэндээ авч үзнэ.Үүнийг шийдэхийн тулд та халах температурыг нэмэгдүүлэхийг оролдож болно;хэрэв гол оргил нь 80°C-90°C-ийн хооронд гарч, янз бүрийн оргил нь температур нэмэгдэхэд дахин гарч ирвэл үндсэндээ ДНХ-ийн бохирдол байгаа гэж үздэг бөгөөд туршилтын эхний шатанд ДНХ-г арилгах шаардлагатай байдаг.

Мэдээжийн хэрэг, зарим нэг хэвийн бус нөхцөл байдал байсаар байгаа бөгөөд тэдгээрийг доор нэг нэгээр нь задлах болно.
3. Ахисан түвшний мэдлэг

qPCR хийхийн тулд би MIQE гэж хэлэх ёстой.Хамгийн бага мэдээлэлНийтлэлд зориулжТоон үзүүлэлтБодит цагийн ПГУТуршилтууд - бодит цагийн тоон ПГУ-ын талаархи нийтлэлийг нийтлэх хамгийн бага мэдээлэлтуршилтууд.Хүн бүрийн ойлголтыг хялбарчлахын тулд бид гол агуулгыг хялбарчлах болно.

Та MIQE-ийн эх бичвэрийг интернетээс хайж олох боломжтой бөгөөд хамгийн чухал нь энэ ньнийтлэл нийтлэхдээ өгөх шаардлагатай мэдээллийн хяналтын хуудас .

Шүүгчид эдгээр дэлгэрэнгүй мэдээллийг уншсанаар туршилтын чанарыг дүгнэж болно;Ирээдүйн уншигчид үүнийг туршилтыг давтах эсвэл сайжруулахад ашиглаж болно.
Энэ жагсаалтад жагсаалт бүрийн ач холбогдлыг E эсвэл D тэмдэглэгээгээр тэмдэглэсэн болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй.Энэ нь юу гэсэн үг вэ?E: чухал мэдээлэл (заавал ирүүлсэн байх ёстой);D: хүссэн мэдээлэл (аль болох ихийг өгөх).

MIQE (1) - Туршилтын загвар
Төгсөлтийн сургуулиа төгсөөд хамгаалалтаа дуусгасан олон новшнууд бие даан туршилт зохиож, дэвтэрээ нээж, багшийн хэлснийг хийж чаддаггүй.Үүний үр дүнд туршилтын загвар нь хатуу биш байсан тул сэтгүүлийн редакцийнхан энэ зургийг, тэр зургийг бүтээхийг хүсч байгаа тул тэд үүнийг хийв.Новшийн новшнуудыг ингэж бүтээдэг юм!

Гэртээ ойр, туршилтын эхний зарчим бол тодорхойлох явдал юмтуршилтын логикийн хатуу байдал.Хамгийн үндсэн зүйл бол туршилтын загвар бөгөөд туршилтын дизайны хамгийн чухал зүйл бол зорилтот түүвэр, лавлагаа түүвэр (хяналт), давталтын тоог хэрхэн тохируулах нь туршилтын өгөгдлийг лавлагаа, харьцуулах, үнэмшилтэй болгох явдал юм.

Зорилтот дээжЭнэ нь тодорхой эмчилгээний дараа зорилтот генийг илрүүлэхийг шаарддаг дээжийг хэлнэ.Лавлах дээжЭнэ нь ямар ч эмчилгээгүй дээж бөгөөд үүнийг биологид ихэвчлэн зэрлэг төрөл гэж нэрлэдэг.

Туршилтын хуулбаруудмаш чухал юм.Ерөнхийдөө ятгасан давталтын тоо гурваас дээш байх ёстой.Биологийн хуулбар гэж юу вэ, техникийн хуулбар гэж юу болохыг ялгах шаардлагатай.

Биологийн хуулбарууд: Ижил баталгаажуулах туршилтыг өөр өөр материалаар хийсэн (цаг хугацаа, ургамал, багц, урвалын хавтан).

Биологийн давхардал
Жишээ болгон чинжүүгийн пестицидийн эмчилгээг авч үзье.Бид ABC-ийн гурван ургамал дээр пестицид цацахыг хүсч байна, дараа нь ABC-ийн гурван ургамал нь гурван биологийн хуулбар бөгөөд тэдгээр нь өөр өөр материалаар хийгдсэн ижил баталгаажуулалтын туршилт юм.Гэхдээ туршилтын хувьд хяналт зайлшгүй шаардлагатай байгаа тул бид А ургамлын нэг мөчрийг шүршиж А ургамлын туршилтын бүлэг үүсгэх боломжтой, харин А ургамлын бусад мөчрийг шүршиж хяналтын бүлэг үүсгэхгүй.B болон C-д ижил зүйлийг хий.

Техникийн хуулбар (техникийн хуулбар): Энэ нь үйл ажиллагааны улмаас үүссэн алдаанаас зайлсхийх зорилготой давтан туршилт бөгөөд энэ нь үнэндээ ижил материалд орсон давхар нүх юм.Эмчилгээ ба хяналтын аль алинд нь зорилтот ген болон дотоод лавлагаа генийн хуулбарласан тохиргоо (хамгийн багадаа гурв) байх ёстой.

Техникийн давталт
Пестицидээр эмчилсэн чинжүүг дахин жишээ болгон ав.А ургамлын туршилтын бүлгийн хувьд зорилтот ген болон дотоод лавлагаа генд тус тус 1, 2, 3 гэсэн гурван ПГУ-ын нүх гаргаж, илрүүлсний дараа дундажийг авсан.Ургамлыг хянахын тулд А бүлгүүдийг мөн ижил аргаар эмчилдэг.Үүнтэй адилаар В, С ургамлуудад ижил эмчилгээ хий.Энэ бол техникийн давталт юм.

Үүнийг тэмдэглэх нь зүйтэйСтатистикт ордог зүйл бол биологийн давталт бөгөөд техникийн давталт нь туршилтын явцад санамсаргүй үзэгдэл байгаа эсэхийг шалгах, ингэснээр туршилтын үр дүнг найдвартай болгох, өөрөөр хэлбэл бидний байнга хэлдэгчлэн дундажийг нь авч алдаа гаргахгүй байх зорилготой юм.

Сөрөг хяналтууд - NTC ба NRT
NTC (Загваргүй хяналт), загваргүй хяналтыг туршилтын материал бохирдсон эсэхийг шалгахад ашигладаг.Ерөнхийдөө усыг загвар болгон ашигладаг.Хэрэв флюресцент урвал байгаа бол энэ нь лабораторид нуклейн хүчлийн бохирдол үүссэнийг илтгэнэ.

Эдгээр бохирдол нь: цэвэр бус ус, эндоген ДНХ агуулсан шаардлага хангаагүй урвалж, праймерын бохирдол, лабораторийн тоног төхөөрөмжийн бохирдол, аэрозолийн бохирдол гэх мэтээс RNase цэвэрлэгч болон RNase дарангуйлагчийг ашиглах шаардлагатай.Аэрозолийн бохирдол нь олоход хамгийн хэцүү байдаг.Танай лабораторийг агаарт янз бүрийн нуклейн хүчлүүд түдгэлзүүлсэн утаа шиг төсөөлөөд үз дээ.

NRT (Урвуу транскриптазагүй), урвуу транскрипцгүй хяналт нь сөрөг хяналт болох урвуу транскрипцгүй РНХ бөгөөд энэ нь гДНХ-ийн үлдэгдлийг хянах явдал юм.

Генийн экспрессийг хийх үед урвуу транскрипцийн дараа cDNA-ийн хэмжээг илрүүлэх замаар РНХ-ийн хэмжээг илрүүлдэг.Хэрэв РНХ цэвэршүүлэх үед гДНХ-ийн үлдэгдэл байвал туршилтын үр дүнд алдаа гарна, учир нь бодит үр дүн нь гДНХ ба cDNA юм.Зөвхөн cDNA гэлтгүй нийлбэр түвшинд РНХ-г задлах явцад гДНХ-ийг бүрэн устгах шаардлагатай.

MIQE (2) — жишээ мэдээлэл
Түүврийн мэдээлэл гэж нэрлэгддэг зүйл нь бид qPCR-ийн тухай нийтлэлийг нийтлэхдээ дээжийн мэдээллийг тодорхой тайлбарлах ёстой гэсэн үг бөгөөд энэ нь нийтлэлийн зайлшгүй хэсэг юм.Үүний нэгэн адил бид дээжийг боловсруулахдаа дээжийн хүчинтэй байдлыг баталгаажуулахын тулд өөрсдийн үйл ажиллагааг зохицуулах ёстой.

Дээжийн тайлбар нь зөвхөн үр дүн бөгөөд бид туршилтын туршид авсан материалд илүү их анхаарал хандуулах хэрэгтэй.

Туршилтын материалыг сонгох
Цусны дээж - 4 цагаас илүүгүй шинэ цусыг сонгоно.Эсийн дээж - эрчимтэй өсөлтийн үед шинэ эсийг цуглуулахыг сонгоно.Амьтны эд - Шинэ, эрчимтэй ургаж буй эдийг сонго.Ургамлын эд - шинэхэн, залуу эдийг сонго.

Эдгээр хэдэн өгүүлбэрт шинэ гэсэн түлхүүр үг байдгийг та анзаарсан байх.
Дээрх дээжүүдийн хувьд зах зээл дээрх хамгийн сайн, хэмнэлттэй, тогтвортой иж бүрдэл нь тэдний ДНХ, РНХ-г хурдан бөгөөд амархан гаргаж авдаг Foregene-ийн иж бүрдэл юм.

Цусны ДНХ-ийн мини хэрэгсэл

Эсийн нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Амьтны нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Ургамлын нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Ургамлын нийт РНХ тусгаарлах хэрэгсэл Plus

Ургамлын ДНХ тусгаарлах хэрэгсэл

Туршилтын материалыг хадгалах
Ерөнхийдөө, хэрэв нөхцөл зөвшөөрвөл дээжийг хадгалахыг зөвлөдөггүй.Гэсэн хэдий ч дээж авсны дараа шууд туршилт хийх боломжгүй олон найз нөхөд байдаг бөгөөд зарим нь дээж авахын тулд шингэн азотын савыг талбай руу зөөх шаардлагатай болдог.

Ийм хөдөлмөрч найзын хувьд та урвалжийн хэрэглээний материалыг ойлгодоггүй гэдгийг л хэлж чадна.Одоо олон урвалж хэрэглэдэг компаниуд РНХ-ийн дээжийг тасалгааны температурт хадгалах чадвартай урвалж үйлдвэрлэдэг бөгөөд та тэдгээрийг ашиглах боломжтой.Хадгалах уламжлалт арга бол зөөвөрлөхөд хялбар, шингэн азотын жижиг савыг ашиглан шингэн азотын агуулах юм.Дээжийг лабораторид буцааж авсны дараа -80 хэмийн хөргөгчинд хадгална.

РНХ-тай холбоотой туршилтын хувьд зургаан үгийн зарчмыг баримтлах ёстой.бага температур, ферментгүй,болонхурдан .

Бага температурын тухай ойлголтыг ойлгоход хялбар байдаг;ферментгүй бол RNase нь бидний амьдарч буй дэлхийн хаа сайгүй байдаг (өөрөөр бол та ХДХВ-ийн халдвараар үхэх байсан), тиймээс туршилт хийхдээ RNase-аас хэрхэн зайлсхийх вэ гэдэг нь маш чухал ойлголт юм;хурдан,Дэлхий дээр эвдэгдэхгүй Кунг Фү гэж байдаггүй, зөвхөн хурдыг эвдэж чаддаггүй.

Тиймээс нэг ёсондоо олборлох хугацаа богино байх тусам иж бүрдэл нь илүү сайн байх болно.Яагаад гэжГадаад-ийн хэрэгсэл нь хурдыг онцолж өгдөг, учир нь тэд үүнийг сайн мэддэг.

Жич: Зарим охид туршилтаа маш нямбай хийдэг ч хэдэн жил ажилласны эцэст слэм данк шиг сайн байдаггүй.Тэд Бурханыг шударга бус гэж үзэж, бусдын талаар гомдоллож, амьдралыг эрэлхийлдэг.Үнэндээ тэр үүнийг ойлгосонгүй.Тэр РНХ-г сайн хамгаалж чадаагүй бөгөөд слэм данк тоглодог хүн ч хурдан байсан.Туршилт хийж байхдаа тэрээр гурван удаа, таван удаа, хоёр хуваагдан слэм данкийг дуусгана гэж бодож байсан ч туршилтаа сайн хийсэн.

Анхаарна уу: Удаан, RNase халдлагад өртөх магадлал өндөр.Хурдан байхын тулд өөрийгөө хэрхэн сургах вэ?Арга ч үгүй, илүү их дасгал хий.

Өөр өөр туршилт, өөр өөр дээжийн хувьд илүү их уран зохиол уншиж, боловсруулахад тохирох аргыг сонгох шаардлагатай хэвээр байна.Дээж цуглуулах, хадгалах үйл явцын хувьд MIQE үүнийг цаасан дээр тодорхой бичсэн байх ёстой бөгөөд ингэснээр шүүмжлэгчид цаасны найдвартай байдлыг шалгах боломжтой бөгөөд гайхширсан залуус таны туршилтыг давтахад тохиромжтой.

Хэдийгээр биологийн туршилтууд нь хэцүү ч өндөр чанартай байдаг.Хэрэв та болгоомжтой байхгүй бол дэлхийг сүйрүүлж чадна.Тухайлбал, SARS-ыг биохимийн хямрал болгох, эсвэл эрлийз будаа хийж 1.3 тэрбум хүнийг аврах.Доорх зураг бол химийн туршилт бөгөөд та түүний дик шиг төрхийг хараад л өөрийнхөө судалгаанд ямар бахархаж байгаагаа ойлгох хэрэгтэй.Март, түүнийг харлуулах хэрэггүй.

MIQE (3) – нуклейн хүчлийн олборлолт.
Нуклейн хүчлийн олборлолт нь маш том үйл явдал бөгөөд молекул биологийн бүх туршилтууд нуклейн хүчлийн олборлолтоос эхэлдэг.Юуны өмнө MIQE-ийн агуулгыг нуклейн хүчлийн хандыг хуулж авъя.

Энэ маягтыг харахад та гадаргуу дээр үлдэж чадахгүй.Энэ хэлбэр нь догма юм.Шилдэг оюутан болохын тулд яагаад гэдгийг асуух ёстой.Энэ хүснэгтийн үндсэн агуулга нь: ХүсэлтРНХ-ийн цэвэр байдал, бүрэн бүтэн байдал, тууштай байдал, олборлолтын хэмжээ .

-ийн эхний хэсэгпроцесс эсвэл багаж нь нуклейн хүчлийг олборлох үе шат юм.Хэрэв та автомат нуклейн хүчил олборлогч ашиглаж байгаа бол (дэвшилтэт, худалдан авах бол надтай холбоо барина уу) багажийн загварын нэрийг зааж өгөх шаардлагатай.

Багцын нэр ба

Өөрчлөлтийн дэлгэрэнгүй мэдээлэлд ямар иж бүрдэл ашигласан, ямар тусгай урвалж нэмсэн, ямар тусгай ажиллагаа хийсэн зэргийг тодорхой тайлбарласан байх ёстой бөгөөд ингэснээр бусад хүмүүс таны туршилтыг давтах боломжтой болно.

Зарим хүмүүс тусгай дээж авахдаа энэ бол тэдний нууц зэвсэг гэж бодоод, бусдад хэлэхгүй байхын тулд тусгай урвалж нэмдэг.Нууцлахын зэрэгцээ тэд таны нийтлэлийг гэрэлтүүлэх боломжийг алддаг.Битгий ухаантай бай, шинжлэх ухааны судалгаанд хөдөөгийн өвгөн Жангаас илүү шударга байх ёстой, хэрвээ ухаантай байя гэвэл нийтлэл чамайг тэнэг болгоно.

багцын бүтээгдэхүүний дугаарыг санаж байх ёстойиж бүрдэл захиалж, нийтлэл бичих үед .Иж бүрдэл дээр ерөнхийдөө хоёр дугаар байдаг: Cat—каталогийн дугаар (бүтээгдэхүүний дугаар, барааны дугаар), Багц—бүтээгдэхүүний багцын дугаар (Бүтээгдэхүүнийг аль багцаас ирснийг харуулахад ашигладаг).

Үүнээс гадна биохимийн урвалж захиалахдаа CAS дугаарыг ихэвчлэн ашигладаг бөгөөд би үүнийг хамтдаа сурталчлах болно.CAS дугаар нь Америкийн химийн нийгэмлэгээс шинэ химийн эм болгонд өгдөг дугаар юм.Ерөнхийдөө гурван тоог зураасаар холбодог.Рушуйгийн CAS дугаар: 7732-18-5.Химийн бодисууд ихэвчлэн олон өөр нэртэй байдаг ч CAS дугаар нь өвөрмөц байдаг.Эм захиалахдаа эхлээд CAS дугаарыг нь шалгаж болно.

Гэртээ ойр, бид яагаад эдгээр зүйлсийг тодорхой тайлбарлах ёстой гэж?Үнэн хэрэгтээ энэ нь РНХ олборлолтын чанарыг шалгах явдал юм.Багаж хэрэгсэл, иж бүрдэл ашиглах нь РНХ-ийн олборлолтыг илүү тогтвортой болгоно.Энгийн лабораторийн олборлолтын хэмжээ нь том биш бөгөөд үүнийг иж бүрдэлээр нь авч болно.

DNase эсвэл RNase эмчилгээний дэлгэрэнгүй мэдээлэл
Флюресцент тоон ПГУ-ын чухал асуудал бол ДНХ-ийн бохирдлоос урьдчилан сэргийлэх, хэрэв бохирдол байгаа бол туршилт хийхгүй байх явдал юм.Тиймээс туршилтын явцад ДНХ бүрэн, бүрэн устгагдсан гэдгийг харуулахын тулд ДНХ-г боловсруулахдаа ашигласан үйл явцыг зааж өгөх нь зайлшгүй юм.бүдүүвч диаграмаар дүрсэлсэн.

РНХ ба ДНХ-ийн бүдүүвч диаграм
Ерөнхийдөө ДНХ-г арилгах арга бол олборлосны дараа РНХ-ийг DNase-ээр эмчлэх явдал юм.Гэсэн хэдий ч эдгээр нь харьцангуй хуучин аргууд юм.Арилжааны РНХ олборлох иж бүрдэл нь олборлох явцад ДНХ нэмэлгүйгээр ДНХ-г арилгах боломжтой болсон.Жишээлбэл, Foregene-ийн цуврал иж бүрдэл.

Анхаарна уу: РНХ задлах явцад ДНХ-г арилгах нь маш аюултай хоёр талдаа иртэй сэлэм бөгөөд РНХ задлах үйл ажиллагааны хугацааг уртасгаж, РНХ задрах эрсдэлийг нэмэгдүүлнэ.Үндсэндээ энэ нь РНХ-ийн гарц ба цэвэр байдлын хоорондох солилцоо юм.

Түүнчлэн цахиурт суурилсан шингээх баганад нэмсэн DNase-ийн хэмжээ маш бага тул үр дүнд хүрэхийн тулд өндөр чанартай DNase ашиглах шаардлагатай.Оновчгүй DNase хурдан бөгөөд бүрэн шингэж чадахгүй.Энэ бол худалдаачны техникийн түвшний шалгалт юм.Мэдээжийн хэрэг, ДНХ-ийг DNaseгүйгээр устгаж болно гэж сайрхдаг илүү хачирхалтай худалдаачид байдаг.DNase-гүй ДНХ-г бүрмөсөн арилгана гэж онгирдог хэнийг ч хулиган гэж хэлж болно.ДНХ нь харьцангуй тогтвортой хоёр судалтай бүтэц бөгөөд үүнийг зүгээр л ярьж, инээснээр устгаж болохгүй.

Бохирдлын үнэлгээ
үнэлгээний арга: электрофорез илрүүлэх, 1% агароз, 6V/см, 15мин, ачаалах 1-3 ul

Нуклейн хүчлийн тоон шинжилгээ
ихэвчлэн хэт ягаан туяаны спектрофотометр ашиглан хэмждэг.Эхлээд OD260, OD280, OD230 гэсэн гурван утгын утгыг олонд таниулъя.
·OD260nm: Энэ нь нуклейн хүчлийн хамгийн дээд шингээлтийн оргилын шингээлтийн долгионы урт бөгөөд хамгийн сайн хэмжсэн утга нь 0.1-1.0 хооронд хэлбэлздэг.Хэрэв тийм биш бол дээжийг шингэлж эсвэл баяжруулж, хязгаарт ойртуулна.
·OD280nm: Энэ нь уураг, фенолын бодисын шингээлтийн хамгийн дээд оргилын шингээлтийн долгионы урт юм.
·OD230nm: Энэ нь нүүрс ус шингээх хамгийн дээд оргилын шингээлтийн долгионы урт юм.

Дараа нь үзүүлэлт бүрийн гүйцэтгэх үүргийн талаар ярилцъя.A260-ийн хувьд үүнийг нуклейн хүчлийн гарцыг хэмжихэд ашиглаж болно.OD260=1 үед dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Цэвэр байдлын хувьд бид нийтлэг харагддаг харьцааг харах хэрэгтэй: OD260/280 ба OD260/230.
·Цэвэр ДНХ: OD260/280 нь ойролцоогоор 1.8-тай тэнцүү.1.9-өөс их бол РНХ-ийн бохирдол, 1.6-аас бага бол уураг, фенолын бохирдол байгааг илтгэнэ.
·Цэвэр РНХ: 1.7
·OD260/230: ДНХ эсвэл РНХ эсэхээс үл хамааран лавлагааны утга нь 2.5 байна.2.0-оос бага бол элсэн чихэр, давс, органик бодисын бохирдол байгааг илтгэнэ.

РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал

РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг хэмжих нь маш чухал юм.Ерөнхийдөө 28S ба 18S РНХ-ийн хоорондох тод байдал нь хоёр дахин хамааралтай эсэхийг шалгахын тулд РНХ-ийн денатурацийн гель туршилт хийх шаардлагатай.Гурав дахь 5S хамтлаг гарч ирэхэд сээр нуруугүй амьтдыг эс тооцвол РНХ задарч эхэлсэн гэсэн үг.

РНХ-ийн чанарын үнэлгээний өгөгдөл: Дээрх туршилтуудаас гадна РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлын талаар илүү дэвшилтэт багажийн туршилтууд байдаг, тухайлбал Experion автомат электрофорезийн системийн RQI бүрэн бүтэн байдлын тест нь РНХ нь үл үзэгдэх байдлаар доройтсон эсэхийг илрүүлэх боломжтой.

Шинжлэх ухааны судалгаанд флюресцент тоон ПГУ нь зорилтот ген ба дотоод лавлагаа генийн харьцуулалт юм.Тиймээс РНХ-ийн дээжийг хадгалах, РНХ олборлох гэх мэт үйл явцын гол зорилго нь РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг хангах явдал юм.

РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдал нь зорилтот ген ба дотоод лавлагаа генийн хоорондын тэнцвэрт байдалд хэрхэн нөлөөлдөгийг доорх зургаас хялбархан ойлгож болно.Задаргаа нь генийн бүрэн бус байдалд хүргэнэ, дотоод лавлагаа ген бүрэн бус байна уу, зорилтот ген бүрэн бус байна уу, энэ нь өгөгдөлд маш их нөлөөлнө.

Зорилтот ген ба лавлагаа генийн бүдүүвч диаграм нь үнэн байж болохгүй

Дарангуйлах сорил (CT утга нь өндөр эсвэл бага концентраци эсвэл бусад нөхцөлд дарагдсан эсэх)

Энэ зургийг жишээ болгон авч үзвэл таван муруйн Ct утгууд дараах байдалтай байна.Муруйн хоорондох КТ-ийн утгын тархалт жигд бус, өндөр ба бага концентрацийн үед Ct-ийн утгууд хойшлогддог бөгөөд энэ нь ПГУ-ын дарангуйлах тохиолдол юм.

Гол санаа: РНХ гаргаж авах явцад бид буруу ойлголтоос татгалзаж, зөв ​​ойлголтыг бий болгох хэрэгтэй.

Буруу санаа нь: РНХ-ийн олборлолт нь зөвхөн гарцыг дагаж мөрддөг бөгөөд РНХ-ийн хэмжээ их байх тусмаа сайн гэж боддог.Уг нь бид тоон үзүүлэлтийг хийхдээ генийн тоо тийм ч их биш бол РНХ их хэрэггүй.Таны гаргаж авсан РНХ-ийн хэмжээ хангалттай их байна.

Зөв ойлголт нь:РНХ-ийн олборлолт нь цэвэр байдал, бүрэн бүтэн байдал, тууштай байдлыг баримтлах ёстой.Цэвэр байдал нь дараагийн урвуу транскрипцийг саатуулахгүй байх, өгөгдөлд ДНХ нөлөөлөхгүй байхыг баталгаажуулж чадна.Шударга байдал нь зорилтот дараалал болон дотоод лавлагааны тэнцвэрийг хангадаг.Тогтвортой байдал нь дээжийг тогтвортой ачаална.

MIQE (4) – урвуу транскрипци
Буруу ойлголт: илүү өндөр түүврийн эзэлхүүнийг эрэлхийлэх.
Зөв ойлголт: Ачаалагдсан РНХ-ийн хэмжээнээс үл хамааран тууштай байдлыг (тогтвортой байдлыг) эрэлхийл, урвуу транскрипцийн үр ашиг тогтвортой байж, cDNA-ийн ялгаа нь мРНХ-ийн ялгааг үнэхээр тусгаж чадна гэдгийг баталгаажуулна.
Бид энэ үйл явцыг бүдүүвч диаграмаар тайлбарлав.

Урвуу транскрипцийн үр ашгийн бүдүүвч диаграм нь үнэн биш юм
Юуны өмнө бид урвуу транскрипцийн процесс ба ПГУ-ын үйл явцын ялгааг ойлгох хэрэгтэй.ПГУ-д олон тооны халаах, анивчих процесс явагддаг бөгөөд зорилтот фрагмент нь экспоненциалаар ургадаг;Урвуу транскрипцид ийм процесс байдаггүй ч бид урвуу транскрипц нь үнэндээ нэгийг харьцдаг гэж төсөөлж болно.

ЦДНХ-ийн олон ширхэг мэдээллийг авах боломжтой тул үүнийг одоохондоо ойлгох хэрэгтэй, учир нь том жижиг хэсгүүд урвуу хуулбарлагдсан бөгөөд нэг фрагмент дээр анхаарлаа төвлөрүүлэх боломжгүй юм.РНХ-ийн хэмжээ харьцангуй бага байдаг тул олж авсан cDNA-ийн хэмжээ нь олшруулах нөлөөтэй ПГУ-аас ялгаатай нь харьцангуй бага байдаг тул үндсэндээ илрүүлэх боломжгүй юм.

cDNA электрофорезийн үр дүн
Хоёрдугаарт, урвуу транскрипцийг нэг нэгээр нь хийдэг боловч аль ч компанийн урвуу транскриптаз ийм үр дүнд хүрч чадахгүй.Үндсэндээ ихэнх урвуу транскриптазын үр ашиг 30-50% хооронд хэлбэлздэг.Хэрэв тийм бол бид харьцангуй тогтвортой урвуу транскрипцийн үр ашигтай байхыг илүүд үзэж байгаа бөгөөд үүнийг зураг дээр хармаар байна: 3 РНХ 2 cDNA, 6 РНХ 4 cDNA авдаг тул хичнээн хэмжээний дээж ачаалагдсан ч урвуу транскрипцийн үр ашиг харьцангуй тогтвортой байна.Бид урвуу транскрипцийн үр ашиг тогтворгүй, өндөр концентрацийг саатуулдаг нөхцөл байдлыг харахыг хүсэхгүй байна.

Тэгэхээр урвуу транскрипцийн үр ашиг тогтвортой байгаа эсэхийг хэрхэн шалгах вэ?Арга нь маш энгийн, та зөвхөн харьцуулах тест хийх хэрэгтэй: нэг нь РНХ-ийг хоёр дахин шингэрүүлсний дараа cDNA руу урвуу транскрипц хийх, нөгөө нь cDNA руу урвуу транскрипц хийсний дараа хоёр дахин шингэрүүлэлт хийх, дараа нь олж авсан налууг харахын тулд qPCR хийх.Шилдэг оюутны хувьд та үүнийг хэдхэн секундын дотор ойлгох ёстой.Доор үзүүлсэн шиг:

Урвуу транскрипцийн үр ашиг тогтвортой эсэхийг шалгахын тулд РНХ ба cDNA-г шингэлэх
Урвуу транскриптаза ба иж бүрдэл
Хэрхэн төгс флюресцент тоон ПГУ-ын урвуу транскриптаз, иж бүрдэл нь маш сайн байдаг.Урвуу транскриптаза нь AMV эсвэл эх сурвалжийн дагуу хоёр төрөлд хуваагддагM-MLV, тэдгээрийн гүйцэтгэл нь хүснэгтэд үзүүлсэнтэй ижил байна.

RNase H үйл ажиллагаа
RNase H нь Рибонуклеаза H, хятад нэр нь рибонуклеаза Н бөгөөд энэ нь ДНХ-РНХ-ийн эрлийз гинжин хэлхээнд РНХ-г тусгайлан гидролизлэх чадвартай эндорибонуклеаз юм.RNase H нь нэг судалтай эсвэл хоёр судалтай ДНХ эсвэл РНХ дахь фосфодиэфирийн холбоог гидролиз болгож чадахгүй, өөрөөр хэлбэл нэг судалтай эсвэл хоёр судалтай ДНХ эсвэл РНХ-г шингээж чадахгүй.cDNA-ийн хоёр дахь хэлхээний нийлэгжилтэнд ихэвчлэн ашиглагддаг.

Энэ нь хачирхалтай зүйл юм.Урвуу транскриптаз нь RNase H-ийн идэвхжилтэй гэж бид хэлдэг, харин урвуу транскриптаз нь RNase H-ийг агуулдаггүй бөгөөд RNase H-ийг урвуу транскриптазаас салгах боломжгүй байж магадгүй, энэ нь урвуу транскриптаз дахь тодорхой бүлгүүдийн нийцтэй байдлаас болж энэ үйл ажиллагаа нь урвуу транскриптазаас үүсдэг.

Тиймээс AMV-ийн урвуу транскрипцийн үр ашгаас үл хамааран түүний RNase H идэвхжил нь cDNA-ийн гарцыг бууруулдаг.Мэдээжийн хэрэг, урвалж үйлдвэрлэгчид cDNA-ийн гарцыг нэмэгдүүлэхийн тулд урвуу транскриптаз дахь RNase H-ийн идэвхийг аль болох арилгахын тулд бүтээгдэхүүнээ байнга оновчтой болгодог.
Хатаах температур

Өөр өөр температурт РНХ-ийн хоёрдогч бүтэц
Өөр өөр температурт РНХ-ийн хоёрдогч бүтцийг дээрх зургаас харж, тодорхой температур, давсны концентрацийн нөхцөлд зорилтот фрагментийн хоёрдогч бүтцийг тодорхойлохын тулд mFold онлайн хэрэгслийг ашиглана уу.55°С-т РНХ-ийн хоёрдогч бүтэц маш нарийн төвөгтэй хэвээр байгаа бөгөөд урвуу транскриптаза ажиллах боломжгүй, хоёрдогч бүтэц нь 65°С хүртэл бүрэн шийдэгдэх боломжгүй, харин AMV болон M-MLV-ийн оновчтой температур нь энэ температураас хамаагүй бага байдаг.
юу хийх вэ?Хоёрдогч бүтэц нь загвар өөрөө нэмэлт хосолсон хэлбэр бөгөөд энэ нь праймер болон урвуу транскриптаза болон загвар хооронд хүчтэй өрсөлдөөнд хүргэдэг бөгөөд үүний үр дүнд E бага, давтагдах чадвар муу зэрэг олон асуудал үүсдэг.

юу хийх вэ?Зөвхөн хатаах температурыг аль болох ихэсгэнэ.

Олон урвалж үйлдвэрлэгчид генийн инженерчлэлээр урвуу транскриптазыг сайжруулж байна.Зарим нь Жифан, Айделай зэрэг урвалын температурыг нэмэгдүүлж, зарим нь фермент ба РНХ-ийн загвар хоорондын хамаарлыг сайжруулахын тулд RNase H ферментийн идэвхтэй бүлгийг устгадаг.Өндөр ойр дотно байдал нь хоёрдогч бүтцийг өрсөлдөх чадвартай шахаж, жигд уншиж, урвуу транскрипцийн үр ашгийг ихээхэн сайжруулдаг.
Гол санаа: Урвуу транскрипц нь ачаалагдсан дээжийн хэмжээнээс илүү урвуу транскрипцийн үр ашгийн тогтвортой байдлыг хангахад илүү чухал (ферментүүд нь зөвхөн үр дүнтэй төдийгүй тогтвортой байх ёстой), хэрвээ энэ нь ялангуяа том хэмжээний флюресцент тоон ПГУ биш бол энэ нь огт боломжгүй болно.Олон cDNA.
Төрөл бүрийн үйлдвэрлэгчид тогтвортой байдлыг эрэлхийлэхийн тулд зарим хүчин чармайлт гаргасан.Жишээлбэл, ихэнх компаниуд урвуу транскрипцийг стандарт иж бүрдэл болгон багцалсан бөгөөд энэ нь сайн сонголт юм.
Жишээлбэл, Foregene-ийн RT Easy Series иж бүрдэл:

RT Easy I (Эхний хэлхээний cDNA синтезийн иж бүрдэлд зориулсан мастер премикс)

MIQE (5) - зорилтот генийн мэдээлэл

Дээрх зурагт тайлбарлав
1. Энэ генийг давтан туршилт хийхэд үр дүнтэй эсэхийг ерөнхийд нь давтан туршилтаар баталгаажуулж болно.
2. Генийн үнэмлэх, чи мэднэ.
3. Генийн урт, зорилтот генийн нийт урт нь мэдээжийн хэрэг асуудал биш юм.Праймерыг зохион бүтээхдээ олшруулалтын үр ашгийг сайжруулахын тулд ампликоны уртыг 80-200bp хооронд байлгах хэрэгтэй.
4. Sequence Blast-ийн харьцуулалтын мэдээлэл, зорилтот генийг өвөрмөц бус олшруулалтаас сэргийлэхийн тулд генийн банкинд харьцуулах шаардлагатай.
5. Псевдоген байгаа эсэх.Псевдоген нь ердийн гентэй төстэй боловч хэвийн үйл ажиллагаагаа алддаг ДНХ-ийн дараалал юм.Энэ нь ихэвчлэн эукариотуудын олон генийн гэр бүлд байдаг.Энэ нь ихэвчлэн ψ-ээр илэрхийлэгдэнэ.Энэ нь кодлогч генийн дараалалтай маш төстэй геном дахь функциональ бус геномын ДНХ хуулбар юм., ерөнхийдөө хуулбарлагдаагүй, физиологийн тодорхой утгагүй байдаг.
6. Экзон ба интронтой харьцуулахад праймеруудын байрлал.ДНХ-ийн бохирдлын асуудлыг шийдэх эхний жилүүдэд бид ихэвчлэн праймер, экзон, интронуудын байрлалд анхаарлаа хандуулдаг байсан бөгөөд ДНХ-ийн олшрохоос зайлсхийхийн тулд ерөнхийдөө интроноор дамждаг праймеруудыг төлөвлөдөг байсан.Доорх зургийг харна уу: хар нь интроныг, янз бүрийн хөх нь экзоныг, ягаан нь энгийн праймерыг, тод улаан нь интроныг хамарсан праймерыг төлөөлдөг.

Схем, хэзээ ч үнэн биш
Энэ нь ямар төгс төлөвлөгөө мэт санагдаж байна, гэхдээ үнэндээ ихэнх тохиолдолд транс-интрон праймерууд нь төсөөлж байгаа шиг ид шидтэй байдаггүй бөгөөд тэдгээр нь өвөрмөц бус өсгөлтийг үүсгэдэг.Тиймээс ДНХ-ийн бохирдлоос сэргийлэх хамгийн сайн арга бол ДНХ-ийг бүрэн устгах явдал юм.
7. Конформацийн таамаглал.Энэ жишээг дахин ашиглан mFold онлайн хэрэгслийг ашиглан тодорхой температур, давсны концентраци дахь зорилтот фрагментийн хоёрдогч бүтцийг тодорхойлно.

Өөр өөр температурт РНХ-ийн хоёрдогч бүтэц
Хоёрдогч бүтэц нь загвар өөрөө нэмэлт хосолсон хэлбэр бөгөөд энэ нь праймер болон загвар хосын хооронд хүчтэй өрсөлдөөн үүсгэх бөгөөд праймерыг холбох магадлал бага тул E бага, давтагдах чадвар муу зэрэг олон асуудал үүсдэг.Програм хангамжийн таамаглалаар дамжуулан хоёрдогч бүтцийн асуудал байхгүй бол энэ нь маш сайн байх болно.Хэрэв байгаа бол бидний дараагийн нийтлэл энэ асуудлыг хэрхэн шийдвэрлэх талаар тусгайлан авч үзэх болно.

MIQE (6) - qPCR олигонуклеотидууд

Флюресцент тоон ПГУ-ын хувьд таны өдөр бүр тулгардаг хамгийн эхний зүйл бол РНХ-ийн олборлолт, хоёр дахь нь праймер дизайн байж болно.
Юуны өмнө бид MIQE хяналтын хуудасны дагуу праймер дизайны дүрмийг шалгасаар байна.Энэ нь маш энгийн бөгөөд новшнууд инээж чадна, бид үүнийг нэг өгүүлбэрээр дуусгаж чадна: праймерын датчикийн дараалал, байрлал, өөрчлөх аргыг олж мэдээрэй.Праймерыг цэвэршүүлэх аргын хувьд праймерын нийлэгжилт маш хямд байгаа тул qPCR нь PAGE болон түүнээс дээш цэвэршүүлэх аргуудыг ашиглахад тохиромжтой бөгөөд синтезийн хэрэгслийн мэдээлэл чухал биш юм.Олон хүмүүс хэдэн арван жилийн турш праймер хийж байгаа бөгөөд синтезатор нь ABI3900 гэдгийг мэддэггүй.
Праймерын дизайны зарчмуудын тухайд та тэдгээрийг цээжлэх шаардлагагүй, учир нь ихэнх праймер дизайны програм хангамж эсвэл онлайн хэрэгслүүд эдгээр асуудлыг шийдэж чадна (зөвлөдөг онлайн хэрэгсэл primer3.ut.ee/), мөн праймер дизайныг 99.999% гараар хийдэггүй Хараач, зохиогч заримдаа өдөрт хэдэн зуун праймер зохион бүтээдэг, хэрэв та нэг нэгээр нь уншвал энэ нь хөндлөн гарах болно.
Праймерыг зохион бүтээсний дараа дараах зүйлсийг шалгана уу.
1. Дизайн праймеруудыг 3′-ийн төгсгөлд ойртуулах: Урвуу транскрипцийн үр ашиг ба РНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг харгалзан cDNA-ийн эхний хэлхээний нийлэгжилтэд олиго dT праймерыг ашиглах тохиолдолд олшруулалтын үр ашгийг дээшлүүлэхийн тулд загварчлагдсан праймеруудыг 3′ төгсгөлд ойртуулах шаардлагатай.Зургийг ашиглан дараах байдлаар тайлбарлана уу (үүнийг ойлгох арга байхгүй):

Яагаад праймерыг 3′ төгсгөлд ойртуулах ёстой гэж энэ нь үнэн биш байх ёстой
2. TM утга: Tm утга нь 55-65°С (учир нь экзонуклеазын идэвхжил 60°C-д хамгийн их байдаг), GC агууламж 40%-60% байна.
3. BLAST: Геномын өвөрмөц бус олшрохоос зайлсхийхийн тулд Blast-ийг нэмэлт баталгаажуулалтад ашиглах ёстой.

MIQE(7)—qPCR процесс

1. qPCR иж бүрдэл
MIQE-ийн шаардлагын дагуу бид ПГУ-ын урвалын системийн тохиргоо, ямар иж бүрдэл ашигласан, үйлдвэрлэгч нь хэн бэ, урвалын систем хэр том вэ, будгийн арга эсвэл датчикийн арга хэрэглэж байгаа эсэх, ПГУ-ын програмын тохиргоо зэргийг багтаасан урвалын бүрэн нөхцлийг нийтлэлд тодорхой тайлбарлах ёстой.Ахмад жолооч нар иж бүрдлийг сонгосон л бол дээрх мэдээлэл үндсэндээ тодорхойлогддог гэдгийг олж мэдэх болно.
Одоогийн байдлаар флюресцент тоон ПГУ-ын иж бүрдэл үйлдвэрлэх, үйлдвэрлэх нь маш боловсронгуй технологи юм.Хэрэв та маш муу үйлдвэрлэгчдийг сонгохгүй бол асуудал гарах магадлал өндөр биш боловч бид тантай хэдэн зүйлийг хуваалцахыг хүсч байна:
Халуун эхлэх Taq фермент:ПГУ-ын хамгийн чухал хэсэг нь халуун эхлэлийн Taq фермент юм.Зах зээл дээрх халуун эхлүүлэх ферментийг ерөнхийд нь хоёр төрөлд хуваадаг бөгөөд нэг нь химийн хувьд өөрчлөгдсөн халуун эхлүүлэх фермент (та үүнийг парафин шигтгэнэ гэж төсөөлж болно), нөгөө нь эсрэгбиеийг өөрчлөх халуун эхлүүлэх фермент (эсрэгтөрөгч-эсрэгбие холбох) юм.Химийн өөрчлөлт нь ферментийг халуун эхлүүлэх эхний арга юм.Тодорхой температурт хүрэхэд фермент үйл ажиллагаагаа суллана.Эсрэг биетээр өөрчилсөн халуун эхлүүлэх фермент нь биологийн аргыг ашиглан ферментийн үйл ажиллагааг блоклодог.Тодорхой температурт хүрэхэд эсрэгбие нь уураг болон идэвхгүй болж, ферментийн үйл ажиллагаа идэвхжинэ.

Гэсэн хэдий ч үүнийг ашиглах нь юу вэ?Энэ нь эсрэгбиемийг өөрчилсөн ферментийн ялгарах үйл ажиллагаа нь химийн хувьд өөрчлөгдсөн ферментүүдээс хурдан байдаг тул мэдрэмжийн хувьд эсрэгбие өөрчилсөн ферментүүд бага зэрэг давуу талтай тул зах зээл дээр иж бүрдэлд үндсэндээ химийн хувьд өөрчлөгдсөн фермент байдаггүй.Хэрэв байгаа бол энэ үйлдвэрлэгчийн технологи мянганы эрин үед гацсан хэвээр байна.
Магнийн ионы концентраци:ПГУ-ын урвалд магнийн ионы концентраци маш чухал байдаг.Тохиромжтой магнийн ионы концентраци нь Taq ферментийн идэвхийг ялгаруулж чадна.Хэрэв концентраци хэт бага байвал ферментийн үйл ажиллагаа мэдэгдэхүйц буурах болно;хэрэв концентраци хэт өндөр байвал ферментийн катализаторын өвөрмөц бус олшруулалт нэмэгдэнэ.Мөн магнийн ионы концентраци нь праймерыг нөхөх, загвар ба ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хайлах температурт нөлөөлж, улмаар олшруулсан фрагментийн гарцад нөлөөлнө.Магнийн ионы концентрацийг ерөнхийдөө 25 мм-д хянадаг.Мэдээжийн хэрэг, сайн хэрэгсэл авахын тулд магнийн ионы концентрацийг сайтар хянаж байх ёстой.Зарим худалдаачид магнийн ионы концентрацийг автоматаар тохируулах үр дүнд хүрэх боломжтой урвалж руу магнийн ионы хелат бодис нэмдэг.
Флюресцент будгийн концентраци:Флюресцент будаг буюу бидний ихэвчлэн хэрэглэдэг SYBR Green нь хоёр судалтай ДНХ-ийн жижиг ховилтой холбогдож флюресцент үүсгэдэг, учир нь будгийг давхар судалтай ДНХ-тэй холбох нь өвөрмөц бус байдаг, өөрөөр хэлбэл хоёр судалтай ДНХ үүнтэй нийлсэн л бол флюресцент болон праймерууд нь DNA-тай холилдох болно. дэвсгэр дохио үүсгэдэг.
Жич: Гэрэлд мэдрэмтгий шинж чанартай тул зах зээл дээрх бүтээгдэхүүнийг ихэвчлэн бор тунгалаг центрифугийн хоолойд савладаг (доорх зурагт үзүүлсэн шиг).Гэсэн хэдий ч энэ нь асуудалтай тулгарах болно.Дээж авах үед шингэнийг сорж байгаа эсэхийг харахад хэцүү байдаг.Энэ утгаараа Чинкэ нь үнэхээр хэрэглэгчдэд хамгийн ээлтэй (доорх зурагт үзүүлсэн шиг) бөгөөд тунгалаг хоолойг тунгалаг цагаан тугалгатай уутанд савласан байдаг.Дараа нь гэрэл, дээж авахаас зайлсхийхэд хялбар байдлыг харгалзан цагаан тугалга уутанд хийнэ.Та зөв бүтээгдэхүүний дугаарыг сонгох ёстой.TSE204 бол маш хэмнэлттэй төхөөрөмж бөгөөд энэ нь намайг зүлэг тарих хүслийг төрүүлдэг.

Флюресцент будгийн концентраци нь бас маш чухал юм.Хэрэв концентраци хэт бага байвал олшруулах муруй нь дараагийн шатанд өсөхгүй бөгөөд төгс биш юм;хэрэв концентраци хэт өндөр байвал энэ нь дуу чимээний саад учруулна.Флюресцентийн тоон ПГУ нь CT-ийн утгаас голчлон хамаардаг тул флюресцент будгийн концентрацийг зөв тохируулаагүй бол доод цэг нь өндөр цэгээс илүү сайн байдаг.Мэдээжийн хэрэг, тохирох будгийн концентраци нь хамгийн тохиромжтой.

ROX: ROX будаг нь сайн флюресценцийн дохионы алдааг засахад хэрэглэгддэг.Зарим багаж үйлдвэрлэгчид шалгалт тохируулга хийхийг шаарддаг бол зарим нь тийм биш юм.Жишээлбэл, Thermo Fisher Scientific-ийн бодит цагийн ПГУ-ын олшруулалтын хэрэгслийг ашиглахад ихэвчлэн 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus гэх мэт шалгалт тохируулга хийх шаардлагатай. Иж бүрдэлийн ерөнхий зааварт үүнийг тайлбарлах болно.
Foregene-ийн qPCR Mix нь мөн янз бүрийн загварт хэрэглэхэд тохиромжтой ROX будаг агуулсан байдаг.

Бодит цагийн ПГУ-ын хэрэгсэл-Такман

Устөрөгчийн холбоо сул эмчилгээ: Устөрөгчийн сул холбоог эмчлэх нь харьцангуй техникийн асуудал юм.Олон багцын гарын авлагыг юу ч уншаагүй боловч тэдний хэн нь ч энэ сэдвийг дурдаагүй.Үнэндээ энэ нь маш чухал юм.Суурийн хослол нь устөрөгчийн бондын бат бөх чанараас ихээхэн хамаардаг.Хүчтэй устөрөгчийн холбоо нь ердийн олшруулалт бөгөөд сул устөрөгчийн холбоо нь өвөрмөц бус олшроход хүргэдэг.Хэрэв устөрөгчийн сул холбоог сайн арилгаж чадахгүй бол өвөрмөц бус олшрохоос зайлсхийх боломжгүй.Зохиогчийн хүрээнд энэ асуудлыг хэдхэн компани анзаарсан.Та иж бүрдэл худалдаж авахдаа сонгохыг хүсч буй иж бүрдэлийнхээ талаар энэ талаар ямар нэгэн шийдэлд хүрсэн эсэхээ лавлаж болно.

Урвалын хэмжээ: 20-50ul системийг илүү өргөн ашигладаг бөгөөд бага хэмжээний эзэлхүүн нь алдаа гаргах магадлалтай.Ерөнхийдөө багцын зааварт ПГУ-ын урвалын хэмжээг ашиглахыг зөвлөж байна.Зардлаа хэмнэхийн тулд ухаалаг байж болохгүй, бага хэмжээгээр ашигла.-ийн зорилго.Худалдаачдын санал болгосон эзлэхүүнийг үнэхээр туршиж үзсэн бөгөөд бага хэмжээний эзэлхүүнээс үүссэн алдааны асуудлыг шийдэж чадахгүй байж магадгүй юм.
2. Хоолойн хавтанг үйлдвэрлэгч болон барааны дугаар
Флюресцент тоон ПГУ-ын зарчмыг хүн бүр мэддэг.Флюресценц цуглуулах ажлыг голчлон ПГУ-ын хоолойн таглаагаар хийдэг.ПГУ-ын хэрэглээний материалыг сонгохдоо гэрлийн дамжуулалт сайн, багаж хэрэгсэлд тохиромжтой гэсэн хоёр зүйлд анхаарлаа хандуулаарай.Ерөнхийдөө үндсэн брэндүүдийн самбар, хоолой нь сайн байдаг, гэхдээ та дасан зохицох тал дээр анхааралтай сонгох хэрэгтэй, эс тэгвээс та багажийг ашиглах боломжгүй болно.

4. Дээд түвшний мэдлэг

MIQE (8) - qPCR баталгаажуулалт
Энэ бол qPCR-ийн тэргүүлэх чиглэл юм!Энд маш олон баатрууд элсэнд унасан.Мэдээжийн хэрэг та азтай, судалсан генүүд нь энгийн тул мөсөн агуйгаар салхины дагуу хөвж явсан байж магадгүй юм.qPCR-ийн баталгаажуулах мэдээлэл нь өгөгдлийн найдвартай байдлыг шалгах зорилготой юм.Бид шаардлагатай баталгаажуулалтын мэдээллийг дараах байдлаар жагсаав.

1. Онцлог байдлын тест
Зорилтот генийн олшруулалтын өвөрмөц чанарыг электрофорезийн зураг нь нэг тууз байгаа эсэхийг шалгах замаар шалгадаг;дарааллын баталгаажуулалт;оргил газрын зураг дан байгаа эсэхийг хайлах муруй;ферментийн боловсруулалтыг шалгах болон бусад аргууд.
Энд бид т дээр анхаарлаа хандуулж байнамуруйн хайлах аргыг ашиглан өвөрмөц бус олшруулалтын шинжилгээ.Ерөнхийдөө бид праймерыг зохион бүтээхдээ бүтээгдэхүүний фрагментийн хэмжээ нь 80-200bp-ийн хооронд байх шаардлагатай бөгөөд энэ нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хайлах температурыг 80-85 ° C болгодог.Тиймээс, хэрэв янз бүрийн оргилууд байгаа бол бусад өвөрмөц бус өсгөлтийн бүтээгдэхүүн байх ёстой;хэрэв оргил нь 80 ° C-аас доош байвал энэ нь ерөнхийдөө праймер димер гэж тооцогддог;Хэрэв оргил нь 85 хэмээс дээш байвал энэ нь ерөнхийдөө ДНХ-ийн бохирдол эсвэл том хэсгүүдийн өвөрмөц бус олшруулалт гэж тооцогддог.
Тайлбар: Заримдаа 80 ° C-д зөвхөн ганц оргил байдаг.Энэ үед энэ үзэл баримтлалыг баримтлах ёстой.Олшруулах үр дүн нь бүгд праймер димер байх магадлалтай.

Хэвийн хайлах муруй (өвөрмөц бус олшруулалтгүй нэг оргил)

Асуудалтай хайлах муруй (хуурамч оргилуудын өвөрмөц бус олшруулалт)
【Хэргийн шинжилгээ】

Гол оргил байдаг, гэхдээ праймер димер нь ноцтой юм
Доорх зураг дээрх нэг оргил хайлах муруй нь төгс туршилт гэж бодоод нүдийг тань амархан хуурч болох ч үр дүн нь огт буруу байна.Энэ үед бид хайлах температурыг харах хэрэгтэй.Оргил температур нь 80 ° C-аас бага байдаг бөгөөд энэ нь бүрэн праймер-димер юм.

Зорилтот фрагмент байхгүй, бүх праймер димерүүд
Энд ах минь зогсоож чадахгүй байна.Доорх зураг бол новшийн над руу явуулсан гар утсаар авсан зураг.Түүний ашигласан урвалжууд нь бүгд салбартаа түгээмэл хэрэглэгддэг брэндүүд юм.Тэрээр нэг T-prefix брэндээс өөр T-prefix брэнд болж өөрчлөгдсөн.Та аль хэдийн таамагласан гэж бодож байна.Новш над руу уйлж: "Эхний зурган дээр ашигласан урвалж нь дэндүү сайн, оргил нь дан байна.Дараа нь таны санал болгосон урвалжийг хэрэглэсний дараа энэ нь хоёр дахь зураг шиг холимог оргилуудтай болно.Чи намайг өрөвдөлтэй болгочихлоо."
Хоёр графикийг салга.Өнгөц харахад нэг нь нэг оргилтой, нөгөө нь давхар оргилтой.Дэмий, ганц оргил нь мэдээж зүгээр.Энэ үнэн үү?
Доу Э-ээс ч дор, доорх зурган дээр хоёр зургаа тавьчихвал шууд ойлгох болно.Үнэндээ бид ийм дүр зурагт амархан саажилттай байдаг.Нарийвчилсан дүн шинжилгээ хийсний дараа бид дараахь зүйлийг олж мэдсэн: эхний зургийн оргил нь 75 ° C-д байдаг бөгөөд энэ нь бүрэн праймер димер юм;Хоёр дахь зургийн оргил нь 75 ° C ба 82 ° C-т гарч ирдэг, хамгийн багадаа байдаг Бүтээгдэхүүн гарч ирдэг.

Сурагчдын санал хүсэлтийн зураг
Тиймээс үндсэн асуудал нь урвалжуудын асуудал биш, харин праймер дизайны асуудал юм.Үүний зэрэгцээ зарим томоохон брэндүүд төмрийн чанаргүй гэдгийг бас нотлохын зэрэгцээ ахын өмнө хэлсэн үг: Таны нийтлэлийг дэмждэг урвалжийн брэнд биш юм.Энэ бол урвалжийн брэндийг дэмжсэн таны нийтлэл юм.Зүгээр л төсөөлөөд үз дээ, хэрэв новш урвалжуудыг солихгүй бол журнал руу буруу мэдээлэл илгээгдэж, юу тохиолдох нь эмгэнэл болно.
2. Хоосон хяналтын Ct утга
Тайлбарлах хэрэггүй, хэрэв хоосон хяналт нь Ct утгатай бол энэ нь бохирдол биш гэж үү?Гэсэн хэдий ч та ямар хоосон удирдлага Ct утгатай болохыг ойлгох хэрэгтэй.ГССҮТ юм бол урвалж бохирдсон гэх мэт гадны ДНХ байгаа гэсэн үг.Хэрэв энэ нь NRT бол олборлосон РНХ нь ДНХ-ийн бохирдолтой гэсэн үг юм.
3. Стандарт муруй
Налуу болон тооцооллын томъёог оруулаад ПГУ-ын үр ашгийг томъёогоор тооцоолж болно.Төгс туршилт хийхэд стандарт муруйны налууг 3.32, R² нь 0.9999-д ойртох шаардлагатай.
4. Шугаман динамик хүрээ
Урвалын динамик хүрээ шугаман байна.Стандарт муруйг үүсгэхэд ашигласан загварын дагуу динамик мужид хамгийн багадаа 5 концентрацийн градиентийг багтаасан байх ёстой бөгөөд өндөр концентраци градиент, бага концентрацитай үед Ct утгын өөрчлөлтийг анхаарч үзэх хэрэгтэй.
5. Илрүүлэх нарийвчлал
qPCR-ийн үр дүнгийн өөрчлөлт, өөрөөр хэлбэл давтагдах чадвар муу, өөрөөр хэлбэл нарийвчлал муу байгаа нь температур, концентраци, ажиллагаа зэрэг олон хүчин зүйлээс шалтгаална.Хуулбарын тоо буурах тусам qPCR-ийн нарийвчлал ерөнхийдөө багасдаг.Туршилтын доторх өөрчлөлт нь хамгийн тохиромжтой нь энэ техникийн өөрчлөлт нь биологийн өөрчлөлтөөс ялгаатай байх ёстой бөгөөд биологийн хуулбарууд нь бүлэг эсвэл эмчилгээний хоорондох qPCR үр дүнгийн статистикийн ялгааг шууд шийдвэрлэх боломжтой.Ялангуяа оношилгооны шинжилгээний хувьд сайтууд болон операторууд хоорондын хамгийн сайн шинжилгээний нарийвчлалыг (давтах чадвар) мэдээлэх ёстой.
6. Илрүүлэх үр ашиг ба LOD (мултиплекс qPCR-д)
LOD нь илэрсэн эерэг дээжийн 95% буюу хамгийн бага концентраци юм.Өөрөөр хэлбэл, зорилтот генийн хуулбарт агуулагдах LOD-ийн концентраци нь бүтэлгүйтсэн урвалын 5% -иас хэтрэхгүй байх ёстой.Мультиплекс qPCR шинжилгээ хийхдээ, ялангуяа цэгийн мутаци эсвэл полиморфизмыг нэгэн зэрэг илрүүлэхийн тулд мультиплекс qPCR нь нэг хоолойд олон зорилтот фрагментийн нарийвчлал алдагдаагүй, олон илрүүлэлт, нэг хоолой илрүүлэх үр ашиг, LOD ижил байх ёстойг нотлох шаардлагатай.Ялангуяа өндөр концентрацитай зорилтот ген, бага концентрацитай зорилтот генийг нэгэн зэрэг олшруулж байгаа тохиолдолд энэ асуудалд анхаарлаа хандуулах хэрэгтэй.
Асуудал ба шийдэлЕрөнхийдөө qPCR дибаг хийхэд ихэвчлэн тулгардаг асуудлууд нь дараах асуудлуудад төвлөрдөг.
· өвөрмөц бус олшруулалт
·Праймерын концентрацийг сонгоход хүндрэлтэй, праймер-димертэй холбоотой асуудал
·Хэвлэх температур буруу байна
·Хоёрдогч бүтэц нь олшруулалтын үр ашигт нөлөөлдөг
өвөрмөц бус олшруулалт
өвөрмөц бус олшруулалттохиолдвол праймерын загвар нь тохиромжгүй эсэхийг ерөнхийд нь авч үздэг боловч хэрэв та праймерыг өөрчлөх гэж яарахгүй байгаа бол эхлээд дараах аргуудыг туршиж үзэж болно (зарчмыг мөн хавсаргасан болно):
·Хэвлэх температурыг нэмэгдүүлэх - сул устөрөгчийн холбоог хадгалах чадваргүй болгохыг оролдох;
·Хэвлэх, сунгах хугацааг богиносгох – устөрөгчийн сул холбоо үүсэх боломжийг багасгах;
·Праймерын концентрацийг багасгах – илүүдэл праймер болон зорилтот бус бүсүүдийг холбох боломжийг багасгах;
Олшруулах үр ашиг бага
Тодорхой бус өсгөлтийн эсрэг нөхцөл байдал - өсгөлтийн үр ашиг бага, өсгөлтийн үр ашгийг бууруулах арга хэмжээ нь яг эсрэгээрээ байна:
·Хэвлэх, сунгах хугацааг уртасгах;
·Гурван үе шаттай ПГУ-д шилжүүлж, зөөлрүүлэх температурыг бууруулах;
·Праймерын концентрацийг нэмэгдүүлэх;
Ps: 90-ээд онд төрсөн олон төгсөлтийн оюутнууд туршилтыг хэрхэн дибаг хийх талаар судлах хүсэлгүй байгаа бөгөөд уг иж бүрдэл нь асуудлыг бүрэн шийдэж чадна гэж найдаж байна (хэрэв та сургуулиа төгссөний дараа урвалжийн компанид очиж судалгаа, боловсруулалт хийхийг хүсч байвал) үнэндээ урвалж үйлдвэрлэгчид ч ингэж боддог, энэ нь тэнэг хэрэг гэж найдаж байна. сул H-бонд шингээх хүчин зүйлсийг нэвтрүүлэх.Асуудлыг хялбархан шийдэхийн тулд тэнэгүүд устөрөгчийн сул холбоог шингээх хүчин зүйл байгаа эсэхийг мэдэхийн тулд урвалж компанийн танилцуулгыг унших шаардлагатай хэвээр байна.
Праймерын концентрацийг сонгоход хэцүү, праймер-димертэй холбоотой асуудал
Арга 1: Ерөнхийдөө qPCR-д зориулсан иж бүрдлийн зааварт санал болгож буй системүүд болон санал болгож буй праймер концентраци байдаг.
Арга 2: Праймерын концентрацийн градиентыг тохируулах замаар дибаг хийх.Доорх зургийг харуулахын тулд компаниас хулгайлсан байна.Доорх зурагт гурван праймер концентрацийн градиент (100nM, 250nM, 500nM) болон дөрвөн загварын концентрацийн градиент (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ашиглан хийсэн флюресценцийн тоон үр дүнг харуулав.Туршилтын үр дүнгийн Ct утгыг дараах байдлаар зурна.

Праймерын концентрацийн сонголт Праймерын концентрац бүрийг дараах байдлаар шугам болгон холбоно.

Праймерын концентрацийг сонгох нь тодорхой, 100нМ ба 250нМ праймерын концентрацийн шугаман хамаарал илүү сайн, 500нМ праймерын концентрацийн шугаман хамаарал харьцангуй муу байна.100нМ ба 250нМ-д 250нМ-ийн Ct утга харьцангуй бага тул праймерын оновчтой концентраци нь 250нМ байна.Ерөнхийдөө хүнд хэлбэрийн праймер-димерүүд хайлах муруйд харагдаж болно.Зохион бүтээгдсэн праймерууд нь праймер-димерээс зайлсхийх боломжгүй бол яах вэ?
Арга 3: Праймерын хэмжээг багасгаж, зөөлрүүлэх температурыг нэмэгдүүлнэ (тайлбарлах шаардлагагүй).
Хатаах температурын эмпирик утга нь 60 ° C байна.Хэрэв та итгэлгүй байгаа бол илүү тохиромжтой температурыг хэрхэн сонгох вэ?Хариулт нь праймерын концентрацийг сонгохтой ижил байна.градиент тест.Асуудлыг тайлбарлахын тулд Bio-rad компаниас зураг ав.Тодорхой зорилтот фрагментийг олшруулахын тулд тус бүр нь гурван давталт бүхий найман температурын градиентийг тохируулах ба олж авсан олшруулалтын муруй нь дараах байдалтай байна.

Хатаах температурын сонголт:
·70°C, 69°C—Үндсэндээ праймеруудыг нэгтгэх боломжгүй тул олшруулалт байхгүй.
·67.3°C – Эхэндээ бага хэмжээний олшруулалттай, Ct утга харьцангуй их байна.
·64.5°C——Ct утга буурна.
·60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, 55.0°C температурт Ct-ийн утгууд үндсэндээ тогтвортой байх хандлагатай байсан ч эцсийн флюресценцийн утга өөр байв.
Хэрхэн сонгох вэ?Зарчим: Эхний зарчим бол Ct-ийн өндөр утга юм.Ижил Ct утгын хувьд димержилт болон өвөрмөц бус өсгөлтөөс зайлсхийхийн тулд илүү өндөр температурыг сонгох хэрэгтэй.Хэдийгээр 55 ° C-д флюресценцийн утга илүү өндөр байдаг ч түүний дотор димер эсвэл өвөрмөц бус олшруулалт байж болно.
Гэхдээ хэрэв та чам шиг ухаалаг бол та мэдээж бодох болно: Логикоор хэлэхэд, ПГУ-ын урвал нь маш тодорхой юм бол праймерын концентраци хамгийн бага шаардлагаас давсан тохиолдолд өндөр, доод цэгүүд нь флюресцент будаг, dNTPs шиг ямар ч нөлөө үзүүлэхгүй.Үнэн хэрэгтээ, зөөлрүүлэх температурыг оновчтой болгохын хэрээр праймерын концентрацийн Ct утгад үзүүлэх нөлөө нь мэдээжийн хэрэг хамгийн бага байх болно.

Хатаах температурыг оновчтой болгож, СТ-д праймерын концентрацийн нөлөөг багасгах болно
Хоёрдогч бүтэц нь олшруулалтын үр ашигт нөлөөлдөг
Асуудлыг тайлбарлахын тулд Био-радаас авсан зургийг авч үзье.Мөн хоёрдогч бүтэцтэй генийг өсгөхийн тулд температурын градиентийг зохион бүтээдэг.

Хоёрдогч бүтэц бий болно
Температурын градиент буурах тусам бүтээгдэхүүн гарч эхлэх ба Ct утга урагшилж 60.7°С-д хамгийн бага утгад хүрч, дараа нь температурын градиент буурах тусам Ct утга ихсэж байгааг харж болно.Үүний эсрэгээр, температур нэмэгдэх тусам хоёрдогч бүтэц нээгдэж, олшруулалтын үр ашиг нэмэгддэг.Тодорхой температурт хүрсний дараа температурыг нэмэгдүүлэх нь олшруулалтын үр ашгийг дээшлүүлэх боломжгүй юм.Учир нь энэ үед праймеруудыг тогтвортой нэгтгэх боломжгүй юм.Тиймээс,хамгийн бага Ct утгатай температурыг хайж олох, энэ нь хоёрдогч бүтцийн загварыг өсгөх хамгийн тохиромжтой температур юм!Мэдээжийн хэрэг, ухаалаг тэнэгүүд хэрэв шаардлагагүй бол праймеруудыг сольж, хоёрдогч бүтцийн бүс нутгаас зайлсхийх нь дээр гэдгийг мэддэг байх ёстой.
5. Хэрэглээний түвшин
MIQE - Өгөгдлийн шинжилгээ

Өгөгдлийн шинжилгээг голчлон флюресцент тоон ПГУ-ын багажаар хийдэг.Өмнөх нийтлэлд туршилтын загварт тайлбарласан хоосон хяналт гэх мэт өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх олон ажил хийгдсэн.Дотоод лавлагааны ген, давталтын тоо гэх мэтийг тодруулсан., энд бид qPCR-ийн хэрэглээг голчлон тайлбарлаж байна.
qPCR нь өргөн хэрэглэгддэг ба туршилтын баталгаажуулалт болон нуклейн хүчлийн оношлогоо нь хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг хувилбарууд юм.
үнэмлэхүй тоон үзүүлэлт
Бүртгэл (анхны концентраци) нь мөчлөгийн тоотой шугаман хамааралтай байдаг.Анхны хуулбарын дугаар нь мэдэгдэж байгаа стандартаас стандарт муруйг зурж болно, өөрөөр хэлбэл олшруулах урвалын шугаман хамаарлыг олж авах боломжтой.Дээжний Ct утгын дагуу дээж дэх концентрацийг тооцоолж болно.Оруулсан загваруудын хэмжээ.

Үнэмлэхүй тоон тооцооны арга
Үнэмлэхүй хэмжигдэхүүнийг стандарт муруй дээр үндэслэсэн байх ёстой.Стандарт муруй гаргахын тулд стандарт шаардлагатай.Ихэвчлэн стандарт нь зорилтот генийг хувилах замаар олж авсан плазмид юм.Энэ яагаад плазмид вэ?Учир нь дугуй хэлбэрийн плазмидын ДНХ нь хамгийн тогтвортой байдаг.Стандарт бүтээгдэхүүнийг 5-6 градиентаар хоёр дахин нэмэгдүүлэх харьцаа (10 дахин шингэрүүлэлт) -ийн дагуу шингэлж, шингэлэх үед жигд байдалд анхаарлаа хандуулаарай.Ct утгыг 15-30 хооронд буулгана.

Стандарт бэлтгэл
Үүний зэрэгцээ шинжилгээнд хамрагдах дээжийг мөн зохих хэмжээгээр шингэлэх ёстой (шингэрүүлэх хүчин зүйлийг санаарай), Ct утга нь 15-30 хооронд байх ёстой.Стандарт бүтээгдэхүүн + шинжилгээнд хамрагдах дээжийг хамтад нь машин дээр тавьдаг.Гүйлтийн дараа стандарт бодисоор стандарт муруй хийж, концентрацийг тооцоолохын тулд турших дээжийг стандарт муруйд оруулав.
Гепатит В вирусын HBV-ийн тоон үзүүлэлт нь ердийн үнэмлэхүй хэмжигдэхүүн бөгөөд 1 мл цусан дахь вирусын хуулбарын тоог тооцоолох боломжтой.
Хуулбарын дугаарыг тооцоолох
Туршилт хийх дээжийн концентраци (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × шингэлэх хүчин зүйл
Дээжийн молекул жин = суурийн тоо × 324
Шинжилгээнд хамрагдах дээжийн хуулбарын дугаар (хуулбар/ul) = турших дээжийн концентраци / дээжийн молекул жин × 6 × 1014

Хуулбарын дугаарыг тооцоолох арга

Дээрх нь тоо хэмжээг тодорхойлох тооцооны арга юм.Энэ бол бага дунд сургуулиа төгсөөд шийдэж болох математикийн бодлого бөгөөд математикийн бодлогыг ерөнхийд нь компьютерээр шийддэг.Ойлгохгүй бол ирээд харилцаж болно.
харьцангуй тоон үзүүлэлт
Шинжлэх ухааны судалгаанд харьцангуй хэмжигдэхүүнийг голчлон ашигладаг.1мл цусанд хэдэн вирус байдаг бөгөөд энэ нь ДНХ-ийн вирус бөгөөд энэ нь харьцангуй тодорхойлогч үйл явдал юм: цусны хэмжээг тодорхойлж болно, ДНХ-ийн вирус харьцангуй тогтвортой байдаг.Гэсэн хэдий ч навчны хэмжээ, жин, эмзэг байдлыг тодорхойлоход хэцүү, олборлосон РНХ-ийн хэмжээг тодорхойлоход хэцүү, урвуу транскрипцийн үр ашгийг тодорхойлоход хэцүү байдаг тул навч дахь тодорхой генийн хуулбарын тоог харьцуулах нь бидэнд хэцүү байдаг.
Тиймээс харьцангуй хэмжигдэхүүн нь дараахь элементийг оруулах ёстой.дотоод лавлагаа ген.
Өөрөөр хэлбэл харьцангуй хэмжигдэхүүн нь зорилтот ген болон дотоод лавлагаа генийн харьцуулалт юм.Нэг эд, ижил эстэй харьцуулахад дээжийн хэмжээ, РНХ-ийн олборлолтын хэмжээ, урвуу транскрипцийн үр ашиг, ПГУ-ын үр ашгийн нөлөө харьцангуй бага байна.Түүврийн хэмжээ бага тул дотоод лавлагаа ген болон зорилтот ген хоёулаа харьцангуй багассан.Тийм ч учраас бид өмнө нь нэгдмэл байдал, тогтвортой байдлыг чухалчилж ирсэн.
Дотоод лавлагаа генүүд нь ерөнхийдөөгэр ахуйн генбүх эсэд тогтвортой илэрхийлэгддэг генийн ангиллыг хэлдэг ба тэдгээрийн бүтээгдэхүүн нь эсийн амьдралын үндсэн үйл ажиллагааг хангахад шаардлагатай байдаг.
Энэ ойлголтыг бүү андуураарай.Гэр ахуйн ген нь биологийн функциональ нэр томъёо, харин дотоод лавлагаа ген нь туршилтын техникийн нэр томъёо юм.Гэр ахуйн генийг дотоод лавлагаа ген болгон сонгохын өмнө баталгаажуулалтыг давах шаардлагатай.
Жишээлбэл, бид доорх зурган дээрх гэр ахуйн хэд хэдэн генийг сонгож, эд эсийн өөр өөр эсүүд дэх экспрессийн түвшинг шалгахад β-2-микроглобулины илэрхийлэл нь бусад гурван генийнхээс эрс ялгаатай тул тэдгээрийг дотоод лавлагаа ген болгон ашиглах боломжгүй болохыг олж мэдэв.

Дотоод лавлагааны генийг залруулах функцийг ойлгосны дараа дотоод лавлагаа генийг нэвтрүүлсэнтэй холбоотойгоор хоёр алгоритмыг гаргаж авдаг.
·давхар стандарт муруй арга
·2 – △△Ct арга (CT утгыг харьцуулах арга)
Хэрэв та төрөл зүйл, генийн функцийг судлах сонирхолтой байгаа бол алгоритмын судалгаагаа орхиж, томъёог шууд ашиглах эсвэл шууд машин ашиглах;Хэрэв та математик, инженерийн чиглэлээр мэргэшсэн залуу бол чөлөөтэй байгаарай.
давхар стандарт муруй арга
Хяналтын дээж болон шинжилгээнд хамрагдах дээжийн зорилтот ген, ахуйн генийг стандарт муруйгаар тодорхойлж, дараа нь харьцангуй илэрхийллийн түвшин болох тооцооллын томъёоны дагуу харьцангуй утгыг тооцоолно.
Давуу талууд: энгийн шинжилгээ, харьцангуй энгийн туршилтын оновчлол
Сул тал: Ген бүрийн хувьд туршилтын тойрог бүр стандарт муруй гаргах ёстой
Хэрэглээ: Генийн илэрхийллийн зохицуулалтыг судлахад хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг, хүлээн зөвшөөрөгдсөн харьцангуй тоон аргын нэг.
Томъёо нь дараах байдалтай байна.

Жишээ нь дараах байдалтай байна.

Тоон үр дүнд үндэслэн харьцангуй хэмжээг тооцоол
2 – △△Ct арга (CT утгыг харьцуулах арга)

Давуу тал: Стандарт муруй хийх шаардлагагүй
Сул талууд: Олшруулалтын үр ашиг 100% дөхөж байна гэж үздэг;стандарт хазайлт < 5%, стандарт муруй ба олшруулалт бүрийн хоорондох үр ашгийг нийцтэй гэж үзнэ;туршилтын нөхцлийг оновчтой болгох нь илүү төвөгтэй байдаг.
Хэрэглээ: Генийн илэрхийллийн зохицуулалтыг судлахад хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг, хүлээн зөвшөөрөгдсөн харьцангуй тоон аргын нэг.

Мэдээжийн хэрэг, олшруулалтын үр ашиг нь ихэвчлэн төгс байх боломжгүй 1. Залруулгын арга: Хэрэв бид зорилтот ген болон лавлагаа генийн өсгөлтийн үр ашиг нь ижил боловч олшруулалтын үр ашиг нь 1-тэй тэнцүү биш гэдгийг мэдэж байвал 2－△△Ct-ийг дараах байдлаар засч болно: (1+E )－△△Ct, жишээ нь ampl9c томъёог зөв гаргасан бол, жишээ нь 0.c. 1.95－△△Ct хүртэл
Одоогоор флюресцент тоон ПГУ-ын тухай агуулга дуусч байна.